全身放射線照射對(duì)B16F10黑色素瘤小鼠的影響

王冰，屈朋歡，王艷華，崔乃鵬，蔡建輝，陳保平

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000;2河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部;3華北油田華苑醫(yī)院;4河北省人民醫(yī)院)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，采用過(guò)繼性細(xì)胞回輸為主要方法的免疫治療是目前公認(rèn)的腫瘤治療新成就。由于腫瘤微環(huán)境中復(fù)雜多變的免疫抑制網(wǎng)絡(luò)限制了免疫治療的實(shí)際效果［1］，目前臨床上常用干擾腫瘤微環(huán)境的方法是全身化療［2］。但是，以環(huán)磷酰胺為代表的化療藥物本身對(duì)惡性腫瘤就有治療效果，對(duì)免疫治療的效果判定存在干擾。根據(jù)既往的研究結(jié)果［3，4］，荷瘤小鼠經(jīng)清髓劑量全身放射線照射(TBI)后免疫力極度下降甚至消失，需經(jīng)骨髓移植才能繼續(xù)存活以完成進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。2013年9月～2013年12月，我們通過(guò)觀察不同劑量TBI后荷瘤鼠的生存及腫瘤生長(zhǎng)情況，篩選出適宜的全身照射劑量，使動(dòng)物模型既能獲得腫瘤微環(huán)境的干擾又能在不應(yīng)用骨髓移植的前提下保證生存，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性C57BL/6小鼠(6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào):SCXK冀2008-1-003);B16F10黑色素瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胰蛋白酶購(gòu)自HyClone公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)及荷瘤小鼠模型制備 B16F10黑色素瘤細(xì)胞株在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，常規(guī)胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，PBS清洗后制備成活細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力＞95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL用于實(shí)驗(yàn)。取0.2 mL活細(xì)胞懸液皮下接種于C57BL/6小鼠背部皮下，建立黑色素瘤小鼠模型。對(duì)照組小鼠于背部皮下注射等量生理鹽水。

1.2.2 移植腫瘤組織學(xué)檢查 細(xì)胞接種7 d后，頸脫位法處死小鼠，剪去皮膚，觀察皮下移植腫瘤的形態(tài)、質(zhì)地和活動(dòng)度等;游離腫瘤組織，常規(guī)固定、石蠟包埋后切片進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察。

1.2.3 荷瘤小鼠放療耐受實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種第7天，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組:TBI 5 Gy組、TBI 7 Gy、TBI 7 Gy組后加骨髓移植組、荷瘤無(wú)照射組(0 Gy TBI)，每組各10只。使用60Co作為荷瘤小鼠的放射源，劑量率為0.5 Gy/min，源皮距為80 cm。第3組在TBI 24 h后經(jīng)尾靜脈注射1×106個(gè)健康C57BL/6小鼠新鮮骨髓細(xì)胞。

1.2.4 移植腫瘤生長(zhǎng)曲線的繪制及荷瘤小鼠生存期記錄 每3～4 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組荷瘤小鼠皮下移植腫瘤的大小，記錄腫瘤結(jié)節(jié)最大長(zhǎng)徑與平均短徑(垂直方向橫徑的平均值)，腫瘤面積=最大長(zhǎng)徑×平均短徑，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。觀察各組小鼠一般狀況，記錄生存期。

1.2.5 荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞水平測(cè)定 荷瘤小鼠放療前后用眼球取血法取外周全血，用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)白細(xì)胞水平，并繪制變化曲線。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析;應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并繪制生存曲線，各組生存曲線比較采用LogRank檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B16F10惡性黑色素瘤小鼠模型的建立 將B16F10活細(xì)胞懸液接種于C57BL/6小鼠皮下第7天，可見(jiàn)移植腫瘤輕微突出皮面，直徑4～5 mm，呈黑色;腫瘤血供豐富，周圍可見(jiàn)新生血管形成，有包膜或假包膜。HE染色結(jié)果顯示，腫瘤組織中可見(jiàn)呈結(jié)節(jié)樣生長(zhǎng)的B16F10移植腫瘤細(xì)胞團(tuán)，呈圓形或橢圓形，周圍有豐富的新生毛細(xì)血管。

2.2 TBI對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 各組荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線如圖1。4組小鼠分別進(jìn)行不同劑量的60Co放射線照射處理，總劑量分別為0、5、7 Gy及7 Gy+骨髓移植，定期測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)面積。與0 Gy TBI相比，接受5 Gy TBI、7 Gy TBI及7 Gy TBI+骨髓移植處理的荷瘤小鼠其腫瘤生長(zhǎng)面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)。

圖1 各組荷瘤小鼠移植腫瘤生長(zhǎng)曲線

2.2 TBI對(duì)小鼠生存期的影響 經(jīng)不同劑量60Co放射線照射后，觀察各組小鼠一般狀況至4周。各組小鼠的生存期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.843)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組荷瘤小鼠生存曲線

2.4 TBI對(duì)荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞水平的影響荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞水平高于對(duì)照組小鼠(P＜0.05)。當(dāng)給予7 Gy TBI后，與放療前比較，荷瘤小鼠白細(xì)胞水平放療后下降了86%～96%(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

腫瘤生物治療是目前公認(rèn)的治療惡性腫瘤的主要手段之一，主要包括細(xì)胞過(guò)繼回輸免疫治療、細(xì)胞因子、基因治療和腫瘤疫苗治療等方法［5～9］。然而腫瘤組織自身產(chǎn)生的機(jī)體免疫耐受及對(duì)局部免疫微環(huán)境的抑制成為影響腫瘤生物治療療效的關(guān)鍵。如何打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受和改變腫瘤微環(huán)境使之產(chǎn)生有利于腫瘤免疫治療的趨勢(shì)是目前亟待解決的主要問(wèn)題。

圖3 TBI對(duì)荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞水平的影響

惡性黑色素瘤發(fā)病隱匿，對(duì)放化療均不敏感，其整體生存率和治愈率并不令人滿意，尤其是針對(duì)晚期惡性黑色素瘤，目前還沒(méi)有行之有效的治療方法［10］。近年來(lái)，惡性黑色素瘤免疫治療的研究備受關(guān)注。然而如何打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受和改變腫瘤微環(huán)境，并使經(jīng)體外活化免疫治療效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤局部微環(huán)境內(nèi)對(duì)腫瘤產(chǎn)生更佳的殺傷效果仍是目前面臨的主要問(wèn)題［11］。已有研究表明，使用化療或放療預(yù)處理后再應(yīng)用免疫治療手段可提高免疫治療的效果，但其作用機(jī)制及療效判定目前仍不明確［2］。

本研究采用B16F10惡性黑色素瘤細(xì)胞株皮下種植的方法制備惡性黑色素瘤小鼠移植腫瘤模型，采用不同劑量TBI作用于荷瘤小鼠，以觀察不同劑量TBI對(duì)荷瘤小鼠生存、移植腫瘤生長(zhǎng)的影響，篩選出既能干擾小鼠腫瘤微環(huán)境又能在不應(yīng)用骨髓移植的前提下保證小鼠存活的適宜TBI劑量，為后續(xù)免疫細(xì)胞過(guò)繼回輸治療奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，通過(guò)皮下接種B16F10黑色素瘤細(xì)胞的方法成功建立了惡性黑色素瘤小鼠模型。與0 Gy TBI相比，給予不同劑量TBI(5 Gy、7 Gy TBI或7 Gy TBI+骨髓移植)處理的荷瘤小鼠移植腫瘤大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明5 Gy或7 Gy照射未能影響小鼠惡性黑色素瘤移植腫瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步觀察不同劑量TBI對(duì)荷瘤小鼠存活的影響，結(jié)果顯示，不同劑量照射組與無(wú)照射相比荷瘤小鼠生存期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，使用60Co作為放射源，在較低的劑量率(0.5 Gy/min)照射下，即使總劑量達(dá)到7 Gy，荷瘤小鼠在不給予同種異體骨髓回輸移植的前提下，仍能長(zhǎng)期在清潔飼養(yǎng)條件下存活，生存期與給予骨髓移植組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果表明，給予7 Gy TBI處理同時(shí)不給予骨髓移植，荷瘤小鼠耐受性較好，且該劑量TBI不影響腫瘤生長(zhǎng)，此為進(jìn)一步細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的療效評(píng)價(jià)提供了必要的基礎(chǔ)。

此外，為了觀察7 Gy TBI處理對(duì)荷瘤小鼠免疫能力的影響，本研究進(jìn)一步測(cè)定了放療前后荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞水平。結(jié)果顯示，白細(xì)胞水平在放療第1天就迅速下降，并能在第7天降至最低值，表明7 Gy TBI可有效抑制荷瘤小鼠的免疫水平，此為進(jìn)一步效應(yīng)細(xì)胞免疫治療提供了條件。

［1］Zhou J，Shen X，Huang J，et al.Telomere length of transferred lymphocytes correlates with in vivo persistence and tumor regression in melanoma patients receiving cell transfer therapy［J］.J Immunol，2005，175(10):7046-7052.

［2］Hatiboglu MA，Kong LY，Wei J，et al.The tumor microenvironment expression of p-STAT3 influences the efficacy of cyclophosphamide with WP1066 in murine melanoma models［J］.Inter J Cancer，2012，131(1):8-17.

［3］Koh AJ，Novince CM，Li X，et al.An irradiation-altered bone marrow microenvironment impacts anabolic actions of PTH［J］.Endocrinology，2011，152(12):4525-4536.

［4］Cao X，Wu X，F(xiàn)rassica D，et al.Irradiation induces bone injury by damaging bone marrow microenvironment for stem cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(4):1609-1614.

［5］Soto BL，Hank JA，Van De Voort TJ，et al.The anti-tumor effect of resveratrol alone or in combination with immunotherapy in a neuroblastoma model［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60(5):731-738.

［6］Rapoport AP，Aqui NA，Stadtmauer EA，et al.Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma［J］.Blood，2011，117(3):788-797.

［7］Pai CC，Kuo TF，Mao SJ，et al.Immunopathogenic behaviors of canine transmissible venereal tumor in dogs following an immunotherapy using dendritic/tumor cell hybrid［J］.Vet Immunol Immunopathol，2011，139(2-4):187-199.

［8］Stewart TJ，Smyth MJ.Improving cancer immunotherapy by targeting tumor-induced immune suppression［J］.Cancer Metastasis Rev，2011，30(1):125-140.

［9］Ochi T，F(xiàn)ujiwara H，Yasukawa M.Requisite considerations for successful adoptive immunotherapy with engineered T-lymphocytes using tumor antigen-specific T-cell receptor gene transfer［J］.Expert Opin Biol Ther，2011，11(6):699-713.

［10］Kammerer PW，Shabazfar N，Palarie V，et al.Therapy and prognosis of extraoral malignant melanoma metastasizing to the jaw:case report and literature review［J］.J Oral Maxillofac Surg，2011，69(4):1229-1234.

［11］Boni A，Muranski P，Cassard L，et al.Adoptive transfer of allogeneic tumor-specific T cells mediates effective regression of large tumors across major histocompatibility barriers［J］.Blood，2008，112(12):4746-4754.