甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力EPR檢測*

張 娟，卿德剛，盧景芬，倪 慧△，孫 宇，賈曉光

1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆烏魯木齊830002；

2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實驗室

甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力EPR檢測*

張 娟1，卿德剛1，盧景芬2，倪 慧1△，孫 宇1，賈曉光1

1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆烏魯木齊830002；

2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實驗室

目的：探討甘草渣總黃酮體外對羥自由基(·OH)的清除作用。方法：利用電子順磁共振(EPR)技術(shù)檢測不同濃度甘草渣總黃酮和甘草查耳酮甲對體外·OH的清除能力。結(jié)果：甘草渣總黃酮在0.25～25mg/mL范圍內(nèi)清除·OH能力隨濃度增加呈上升趨勢，且相同濃度時其清除·OH能力高于甘草查耳酮甲。結(jié)論：甘草渣總黃酮有明顯清除自由基作用，該方法、結(jié)果可作為有效活性成分的初步篩選。

甘草渣；黃酮；電子順磁共振；羥基自由基

羥基自由基是對生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，可使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或基因突變等。許多藥物的作用機(jī)理與藥物清除自由基能力相關(guān)。甘草渣是脹果甘草(Glycyrrhiz inflate Bat.)生產(chǎn)甘草浸膏后的殘留物，含豐富的黃酮，且主要為查耳酮類［1-6］，是寶貴的可再利用資源。已有研究證實甘草總黃酮對羥自由基具有清除作用［7-8］，但是關(guān)于甘草渣黃酮清除羥自由基作用少見報道。查耳酮含還原性較強(qiáng)的酚羥基，本研究利用電子順磁共振(EPR)技術(shù)考察甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力，為闡明其作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 試劑 二甲基吡咯氮酮(DMPO)購自美國Sigma公司，使用前用活性炭純化，使之無順磁信號。水為蒸餾水，其他試劑均為分析純；甘草渣由新疆阿拉爾新農(nóng)甘草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司提供，由本實驗室提取，經(jīng)UV檢測總黃酮含量達(dá)到63%；甘草查耳酮甲為自制，經(jīng)UV、IR、NMR和MS鑒定結(jié)構(gòu)，含量大于95%。

1.2 儀器 ESP-300型電子順磁共振儀(德國Bruker公司)；KQ3200型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Met t ler AE163電子天平、N-1100 EYEL4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑的配制稱取NaCl 9.25g，KH2PO40.135g，Na2HPO4·12H2O1.425 g，將3者置100mL燒杯中，用蒸餾水溶解，以1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.4，配制成0.05mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)。

稱取硫酸亞鐵銨［FeSO4(NH4)2SO4·6H2O］適量，用PBS配制成1.0mmol/L的溶液。DMPO的濃度為0.9mmol/L，避光冷藏。H2O2用蒸餾水稀釋至濃度6%。2.2 測定方法 甘草渣總黃酮和甘草查耳酮甲分別用PBS溶液配置成0、0.25、0.5、5、10、20 mg/mL的溶液，進(jìn)行EPR測試。

2.3 羥基自由基產(chǎn)生體系0.05mol/L(pH=7.4)的PBS溶液，1.0 mmol/L FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O溶液，0.9mmol/LDMPO溶液，6%H2O2溶液。以上4種試劑各取5μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細(xì)管中，然后外加樣品保護(hù)測試管，一并放入EPR波譜儀諧振腔中進(jìn)行測定，作為對照樣品。樣品測定時分別用樣品液代替PBS溶液。

2.4 EPR測試參數(shù)中心磁場(CF)：344.5mT；掃描寬度(SW)：10mT；掃描時間(ST)：60S；調(diào)制幅度(MA)：0.25mT；調(diào)制頻率(MF)：100 KHz；微波頻率(MF)：9.697GHz；微波功率(MP)：20mW；測試溫度(T)：室溫。

2.5 清除率計算I=(h0-hx)/h0×100%，h0表示空白體系中EPR譜信號強(qiáng)度測量平均值，hx為樣品體系中EPR譜信號強(qiáng)度測量平均值，I值越大清除羥自由基能力越強(qiáng)，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度甘草渣總黃酮和甘草查耳酮甲清除羥基自由基能力趨勢圖

3 討論

本實驗室建立了總黃酮提取方法，經(jīng)UV檢測總黃酮含量達(dá)63%。EPR研究表明，該甘草渣總黃酮在0.25～25mg/mL濃度范圍內(nèi)清除·OH自由基能力隨濃度增加呈上升趨勢，且在低濃度0.25mg/mL時對·OH自由基清除率已達(dá)50.53%，一般認(rèn)為對自由基的清除率達(dá)到50%即有較好的清除作用。甘草渣總黃酮中甘草查耳酮甲含量最高［2］，故對其進(jìn)行研究，結(jié)果顯示相同濃度下甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力優(yōu)于甘草查耳酮甲，這可能是甘草渣中多種黃酮類物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，其中是否存在其他具有清除自由基能力的物質(zhì)或者增效物質(zhì)，有待進(jìn)一步考察。

EPR技術(shù)是利用具有未成對電子物質(zhì)在磁場作用下吸收電磁波能量而完成電子能級間躍遷的特性，對順磁性物質(zhì)進(jìn)行檢測和分析的方法，具有靈敏度高、樣品不受破壞和無干擾等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測自由基最直接、最有效的方法之一。本研究利用Fe2+經(jīng)H2O2氧化成Fe3+，并產(chǎn)生短壽命的羥自由基，被自旋捕捉劑DMPO捕捉后，經(jīng)電子順磁共振儀檢測，得到羥基自由基的特征譜圖［9］。該方法快速靈敏，可用于體外對藥物活性成分的初步篩選［9］。

［1］ 張娟，卿德剛，倪慧，等.甘草廢渣中黃酮類化合物的分離及鑒定［J］.中國中醫(yī)藥科技，2009，16(2)：127-128.

［2］ 張娟，倪慧，卿德剛，等.HPLC法指認(rèn)甘草廢渣中黃酮類成分及含量測定［J］.中國中醫(yī)藥科技，2012，19(3)：233-234.

［3］張娟，劉芬，李寧，等.UPLC-TOP-MS法鑒定脹果甘草藥渣中黃酮類成分［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2012.27(6)：558-561.

［4］ 李寧，劉芬，倪慧，等.新疆脹果甘草化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28(5)：368-370.

［5］ 陳超，李寧，倪慧，等.甘草化學(xué)成分分離、細(xì)胞培養(yǎng)和分析研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(3)：188-194.

［6］ 劉芬，李寧，倪慧，等.甘草藥渣的研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13(2)：6-9.

［7］ 吳碧華，龍存國，王曉明，等.甘草總黃酮清除羥自由基作用的體外實驗探討［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，16(1)：3-5.

［8］Zhu SH，He Q，Gong YH，et al.Ef fects of Glycyr rhiza f lavonoid on f ree radical in duced brain lipid peroxident［J］.Pacta Univ Med Tongji，1994，23(2)：125-127.

［9］LU Jingfen，Mutel iefu Gulinuer，LI Tingfeng.Studies of antioxidation activity of natuial products with EPR methods［J］.Chinese Journal of Magnetic Resonance，2010，27(1)：22-31.

Scavenging Effectof Total Flavonoids from Glycyrrhiza Residues on HydroxylRadicalby EPRDeterm ination

ZHANG Juan1,QING Degang 1,LU Jingfen2,NIHui1△,SUN Yu1,JIA Xiaoguang1
1 Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and EthicalMateria Medica,Urumqi830002,China;
2 State Key Laboratory of Natural and Biomimetic drugs in Health Science Center of Peking University

Objective:To study the functions of total flavonoids in glycyrrhiza residues to scavenge hydroxyl radical(·OH).Methods:Scavenging effects of total flavonoids and licochalcone from glycyrrhiza residues in different concentrations on hydroxyl radical in vitro were detected by electron paramagnetic resonance(EPR). Results:As the concentrationsof total flavonoids from glycyrrhiza residues increased,scavenging effectswere raised when total flavonoids from glycyrrhiza residueswere between 0.25 and 25mg/mL,and the capacity of eliminating hydroxyl radical was higher than licochalcone when they were at the same concentration.Conclusion:Total flavonoids in glycyrrhiza residues could scavenge hydroxyl radicalobviously,and themethod could be taken as the firststep to screen active ingredients.

glycyrrhiza residues;flavonoids;electron paramagnetic resonance;hydroxyl radical

R284.1

A

1004-6852(2015)01-0011-02

2013-12-04

新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳青年科技人才專項科研項目(編號2012Y06)。

張娟(1983—)，女，助理研究員。研究方向：天然藥物的分析及制劑研究。

△通訊作者：倪慧(1964—)，女，碩士研究生導(dǎo)師，研究員。研究方向：天然藥物的分析及制劑研究。