微循環(huán)技術(shù)及其在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展＊

曹南開 林 苗 朱裕勛綜述 董世芬審校

微循環(huán)是指直接參與組織、細(xì)胞的物質(zhì)、信息、能量傳遞的血液、淋巴液和組織液的流動(dòng)［1］。多種疾?。ㄈ绺哐獕骸⒐谛牟?、糖尿病、腦血栓、硬皮病、胃腸病等）的發(fā)生發(fā)展均有微循環(huán)障礙。隨著微循環(huán)檢測儀器和方法的進(jìn)步，以及觀察指標(biāo)和操作過程的不斷規(guī)范，其在藥物（如活血化瘀中藥）臨床研究中的應(yīng)用逐漸增加，并成為獲取創(chuàng)新成果的重要技術(shù)平臺(tái)。

1 微循環(huán)檢測技術(shù)

微循環(huán)檢測對(duì)了解人體健康狀態(tài)及疾病的預(yù)防、診斷、治療有較好的指導(dǎo)作用，最早的微循環(huán)研究始于臨床。20世紀(jì)70－90年代，隨著創(chuàng)新藥物研究步伐的加快，新的微循環(huán)技術(shù)為藥物的研發(fā)提供了方法和平臺(tái)，促進(jìn)了基礎(chǔ)研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。目前應(yīng)用的主要微循環(huán)檢測技術(shù)包括動(dòng)態(tài)可視化檢測、激光多普勒血流成像、血液流變性測定等。

1.1 動(dòng)態(tài)可視化技術(shù)

微循環(huán)動(dòng)態(tài)可視化技術(shù)是微循環(huán)研究的主要方法，既可用于臨床微循環(huán)檢測，也可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸系膜、心、腦、腎等器官的微循環(huán)觀察。主要設(shè)備是微循環(huán)顯微鏡，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的顯微鏡有Nikon ECLⅠPSE LⅤ100ND微循環(huán)檢測儀、MT1－1501CB微循環(huán)顯微放大系統(tǒng)等。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及觀察部位不同，顯微鏡配置了一些特殊結(jié)構(gòu)，如載物臺(tái)與物鏡間的較大空間，還有正置、倒置顯微鏡之分，正置顯微鏡適合觀察腦部微循環(huán)，倒置顯微鏡適合觀察腸系膜微循環(huán)等。

與顯微鏡配套的附件主要包括顯微圖像的采集、錄像和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，特別是熒光超敏感攝像機(jī)等配套設(shè)備，可為微循環(huán)動(dòng)態(tài)可視化及多指標(biāo)檢測提供較好的研究條件，適合于較深入的微循環(huán)形態(tài)、動(dòng)態(tài)及細(xì)胞水平的研究［2］。

1.2 激光多普勒血流成像技術(shù)

近年來，激光多普勒血流成像技術(shù)在微循環(huán)血流量的檢測應(yīng)用發(fā)展較快，可直接反映微循環(huán)血流灌注狀態(tài)。該技術(shù)采用小功率激光照射體表，基于多普勒效應(yīng)，再應(yīng)用掃描技術(shù)，將體表血流以彩色圖像顯示于熒屏，采用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件對(duì)微循環(huán)圖像進(jìn)行分析處理，定量測定血流量大小和變化［3］。已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床、科研及藥物評(píng)價(jià)［4，5］。

激光多普勒成像技術(shù)主要包括三種方法：（1）激光多普勒寬場實(shí)時(shí)成像，適用于對(duì)大面積組織血液灌注的動(dòng)態(tài)觀測；（2）光學(xué)相干層析多普勒微血管造影術(shù)，有利于對(duì)淺表微小血管，特別是毛細(xì)血管內(nèi)的血流探測；（3）光聲多普勒測量技術(shù)，對(duì)較大深度組織下微小血管血流探測有較明顯優(yōu)勢(shì)［6］。

1.3 血液流變性檢測技術(shù)

血液流變性與血液微循環(huán)關(guān)系密切。血液流變性檢測主要觀察血管內(nèi)的物質(zhì)流動(dòng)與形變規(guī)律［7］。其相關(guān)檢測指標(biāo)可直接反映血液的黏度和流動(dòng)性，如血液黏度增高時(shí)會(huì)影響血液在微血管內(nèi)的流動(dòng)，影響組織的灌流量［2］，是評(píng)價(jià)藥物療效、論證藥理作用的重要指標(biāo)。

血液流變性檢測儀發(fā)展速度快，有壓力傳感式血液流變儀、圓筒式血液流變儀和錐板式血液流變儀，其準(zhǔn)確性、分辨率、重復(fù)性均不斷提高，且采用多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測。

1.4 其它新型微循環(huán)檢測技術(shù)

科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及研究需求的不斷提高，一些新型微循環(huán)檢測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。例如光聲顯微成像（Photoacoustic Microscopy，PAM）技術(shù)可將光吸收編碼成超聲波，能對(duì)生物組織的同一對(duì)比度源進(jìn)行多尺度的成像研究，而且由于超聲波在組織中的散射遠(yuǎn)小于光的散射，使其成像深度更深［8］。因而能對(duì)深層組織的微循環(huán)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行多尺度在體三維成像，在微循環(huán)研究中具有明顯優(yōu)勢(shì)。

2 微循環(huán)障礙模型的建立及其在藥物研究中的應(yīng)用

微循環(huán)障礙模型的建立是進(jìn)行藥物研究實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，近幾十年來，研究者們積累了多種動(dòng)物、組織器官建立微循環(huán)障礙模型的方法，并逐步建立微循環(huán)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)指標(biāo)的評(píng)價(jià)方法，為相關(guān)疾病的病因病機(jī)和藥物作用研究提供了科學(xué)依據(jù)。

2.1 腸系膜微循環(huán)障礙模型

腸系膜是研究臟器微循環(huán)的良好部位。該模型較多采用大鼠［9］。主要采用鹽酸腎上腺素、脂多糖等在腸系膜局部滴注的方式構(gòu)建，其觀察指標(biāo)包括腸系膜微動(dòng)脈管徑、毛細(xì)血管網(wǎng)交點(diǎn)數(shù)、血液流態(tài)、血液流速、血流恢復(fù)時(shí)間、腸系膜間質(zhì)內(nèi)肥大細(xì)胞脫顆粒以及細(xì)胞黏附分子的表達(dá)等［10－13］。

2.2 耳蝸微循環(huán)障礙模型

耳蝸微血管可為耳蝸提供血液供應(yīng)、提供能量、排出代謝廢物以維持耳蝸內(nèi)環(huán)境［14］。動(dòng)脈粥樣硬化、貧血、糖尿病、血液高黏滯性等均可引起耳蝸微循環(huán)功能失調(diào)或障礙［15］。其動(dòng)物模型主要采用豚鼠，采用光化學(xué)誘導(dǎo)或者五羥色胺（5－HT）置于圓窗膜誘導(dǎo)微循環(huán)障礙［16，17］。因耳蝸血管位置較深，且位于耳蝸骨質(zhì)結(jié)構(gòu)包圍內(nèi)，檢測時(shí)需關(guān)注對(duì)器官結(jié)構(gòu)功能的保護(hù)?？梢酝ㄟ^活體微循環(huán)觀察、激光多普勒血流檢測、組織學(xué)方法和微球檢測等方法，檢測耳蝸側(cè)壁微血管的舒縮、血液流速、紅細(xì)胞流動(dòng)狀態(tài)，以及耳蝸血管的病理變化等［18］。

2.3 軟腦膜微循環(huán)障礙模型

軟腦膜微循環(huán)作為腦組織供血的重要組織，可基本反應(yīng)腦組織的供血情況，并具備連續(xù)、直接觀察其動(dòng)態(tài)變化的優(yōu)勢(shì)［19］。動(dòng)物模型多采用大鼠或小鼠。采用顱窗法觀察軟腦膜微循環(huán)時(shí)，小鼠多采用尾靜脈注射高分子右旋糖酐或脂多糖以及表面滴加去甲腎上腺素建立軟腦膜微循環(huán)障礙模型［20－22］；大鼠多采用頸動(dòng)脈引流法復(fù)制大鼠全腦缺血再灌注（Ⅰ／R）損傷模型［23］。觀察指標(biāo)主要為微動(dòng)脈、微靜脈管徑的變化、血液流速、血流量、白細(xì)胞滾動(dòng)和黏附、白蛋白漏出及每視野毛細(xì)血管交叉網(wǎng)點(diǎn)數(shù)目的變化等。

2.4 心臟微循環(huán)障礙模型

心臟微循環(huán)系統(tǒng)在維持心肌細(xì)胞生命活動(dòng)及保障心臟的正常功能中起著重要作用。因一直處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中，在體心臟的微循環(huán)測定難度較大，心臟微循環(huán)障礙模型的建立方法也較少。有研究者采用結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈前降支建立了心臟缺血再灌注模型，采用可視化技術(shù)觀察心肌表面微循環(huán)動(dòng)態(tài)，采用激光多普勒血流成像技術(shù)檢測心臟表面血流量，并觀察和檢測心臟微血管和心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化、冠狀血管微靜脈管壁白蛋白的漏出及心肌梗死面積等指標(biāo)［24］。

3 微循環(huán)技術(shù)在研究活血化瘀中藥中的貢獻(xiàn)

目前，微循環(huán)研究已經(jīng)由定性描述發(fā)展到定量分析以及細(xì)胞分子生物學(xué)水平的研究［25］，不僅可以應(yīng)用于臨床診斷和治療，還可以作為研究方法和平臺(tái)，用于藥物的藥理學(xué)研究和新藥的開發(fā)。目前利用微循環(huán)技術(shù)對(duì)不同類型藥物進(jìn)行藥理學(xué)研究的成果較多，本節(jié)重點(diǎn)介紹在活血化瘀中藥中的研究進(jìn)展。

活血化瘀類中藥是目前中醫(yī)藥研究的熱門領(lǐng)域之一，主要針對(duì)血瘀證相關(guān)疾病。血瘀證是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論描述的病證，指人體內(nèi)血行不暢、壅阻血脈或血溢脈外、停積為瘀的證候［26］。血瘀證主要與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓等疾病有關(guān)，微循環(huán)障礙為基本病理表現(xiàn)。

20世紀(jì)80年代，有學(xué)者利用微循環(huán)技術(shù)分析比較了丹參、紅花、川芎等20種活血化瘀藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)性微循環(huán)障礙模型的改善作用［13］，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是血流恢復(fù)時(shí)間、血管收縮和恢復(fù)程度等；更早期文獻(xiàn)［27］還報(bào)道了應(yīng)用激光多普勒流速測定儀觀察丹參注射液對(duì)犬腸系膜微循環(huán)影響的研究結(jié)果，選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo)是血液流速及血流量。近年來，微循環(huán)檢測技術(shù)有了較大進(jìn)步，檢測指標(biāo)亦趨于成熟而多樣，因而對(duì)不斷完善動(dòng)物模型建立的方法及不斷細(xì)化病證分類起到了積極作用?！吨腥A人民共和國藥典－臨床用藥須知》（2010版，中藥飲片卷）共收載活血化瘀中藥46味，其中可檢索到有明確微循環(huán)作用的有17味，主要作用為加快血液流速、擴(kuò)大微血管口徑及增加毛細(xì)血管網(wǎng)開放數(shù)目等。研究較多的7味中藥的相關(guān)情況見表1。

表1 7種改善微循環(huán)的常用活血化瘀中藥及檢測技術(shù)和指標(biāo)

其中對(duì)于丹參、川芎和紅花等研究較為深入，其改善微循環(huán)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)較為明晰。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)丹參可以通過抑制白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及抑制肥大細(xì)胞脫顆粒等改善缺血再灌注引起的微循環(huán)障礙［46］；另有報(bào)道，丹參可以作為鈣離子拮抗劑提高體內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）水平；并作為氧自由基清除劑，增加前列腺素Ⅰ2，擴(kuò)張血管、抑制血小板積聚、降低血液黏度、加快血流速度、增加毛細(xì)血管開放數(shù)，從而改善微循環(huán)［47］。丹參素可能是其改善微循環(huán)主要成分［22］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，川芎揮發(fā)油和川芎嗪均具有改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管和增加血流量的作用。川芎嗪是血管組織的鈣離子拮抗劑，不僅可以阻斷胞外鈣離子通過鈣通道內(nèi)流，還可抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣的釋放，從而擴(kuò)張血管，增加血流量，改善微循環(huán)［28］。但也有研究認(rèn)為川芎嗪在川芎中含量甚微，并非川芎復(fù)方應(yīng)用時(shí)的藥效成分［29］，有待進(jìn)一步系統(tǒng)論證。紅花黃色素對(duì)皮下注射腎上腺素和冰水刺激所致大鼠微循環(huán)障礙有較好的改善作用［37］。羥基紅花黃色素A是紅花黃色素中含量較高的成分［48］，為血小板活化因子（PAF）受體抑制劑，可抑制由PAF所致血小板黏附及釋放反應(yīng)，降低血小板內(nèi)游離鈣離子濃度，緩解血栓形成、炎癥反應(yīng)等病理變化，從而改善血液循環(huán)［49］。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，動(dòng)態(tài)可視化檢測、激光多普勒血流成像、血液流變學(xué)檢測等微循環(huán)技術(shù)在近幾年得到較快發(fā)展，觀測指標(biāo)也從單一評(píng)價(jià)發(fā)展到綜合定量評(píng)價(jià)，對(duì)藥物藥效學(xué)研究，尤其是活血化瘀中藥的有效成分、藥理作用及作用機(jī)制研究等有很重要的作用。然而，目前應(yīng)用微循環(huán)技術(shù)研究藥物的實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜，成本較高；而且因?yàn)閮x器、設(shè)備、實(shí)驗(yàn)環(huán)境不同，某些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差別較大；此外，微循環(huán)觀察方法較多，指標(biāo)尚未完全統(tǒng)一。這些因素導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的普適性、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性不夠好。隨著光聲顯微、電子、信號(hào)等技術(shù)的不斷推進(jìn)，微循環(huán)技術(shù)方法也正在逐漸標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、自動(dòng)化，相信在未來微循環(huán)技術(shù)不僅對(duì)藥物研究，而且對(duì)相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后都會(huì)做出更大的貢獻(xiàn)。