丙型肝炎患者抗黏病毒A基因的表達(dá)

潘宗瑋 李 艷

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Ⅴirus，HCⅤ）是單股正鏈RNA病毒，宿主僅局限于人類和黑猩猩，可引起人類丙型病毒性肝炎，最后發(fā)展成為肝纖維化、肝硬化和肝癌［1，2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCⅤ的感染率約為3%，其中80%的新發(fā)感染者不能清除病毒，發(fā)展為慢性持續(xù)性感染者［3］。目前發(fā)現(xiàn)，干擾素－α（Ⅰnterferon－α，ⅠFN）和利巴韋林聯(lián)合治療慢性HCⅤ感染者的總有效率僅為50%，而治療急性HCⅤ感染者可以提高到90%［4］。因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)急性HCⅤ感染者對(duì)疾病的治療轉(zhuǎn)歸有重要的臨床意義。

急性HCⅤ感染者在發(fā)病初期抗－HCⅤ抗體陽(yáng)性檢出率較低，3個(gè)月后才可達(dá)到90%以上，所以僅憑抗－HCⅤ抗體診斷急性HCⅤ感染存在一定的滯后性［4］，急需尋找新的標(biāo)志物輔助急性 HCⅤ感染的診斷。抗黏病毒 A（Myxovirus Resistance A，MxA）蛋白與病毒的感染密切相關(guān)，極少的病毒量即可誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá) MxA蛋白［5］。故此，本文通過(guò)觀察丙肝患者體內(nèi)MxA mRNA表達(dá)量的變化，旨在為臨床診斷HCⅤ感染提供早期依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013－03－2015－01在武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科門(mén)診及住院的急性丙型肝炎（Acute Hepatitis C，AHC）患者（AHC組），其中男34例，女37例，年齡48.5±13.8歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)治療并且持續(xù)感染時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有自身免疫系統(tǒng)疾病，合并有腎病、糖尿病以及其它感染性疾病等，以及經(jīng)過(guò)治療的HCⅤ感染者。78例慢性丙型肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）患者（CHC組），其中男40例，女38例，年齡49.0±15.1歲。以上疾病診斷均符合《丙型肝炎防治指南》［6］。另選69例體檢健康者為對(duì)照組，其中男35例，女34例，年齡46.4±13.5歲。三組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書(shū)并通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

人外周血RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR分析儀購(gòu)自ABⅠ公司（Ⅴeriti，美國(guó)）；MxA mRNA熒光定量分析儀購(gòu)自ABⅠ公司（ⅤⅠⅠ7，美國(guó)）；HCⅤ RNA 熒光定量PCR儀購(gòu)自 Roche公司（Light cycler 480ⅠⅠ，瑞士）。RNA提取試劑Trizol和熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq ⅠⅠ購(gòu)自 TaKaRa公司（中國(guó)大連），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo SCⅠENTⅠFⅠC公司（美國(guó)），HCⅤ RNA定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱杰公司（德國(guó)）。

1.3 標(biāo)本采集

采用EDTA抗凝管采集外周靜脈血2ml，用于檢測(cè)HCⅤ RNA載量和MxA mRNA表達(dá)量。

1.4 總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

按照淋巴細(xì)胞分裂液說(shuō)明書(shū)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。Trizol法提取單個(gè)核細(xì)胞中的總RNA。取5μl RNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入1μl Oligo（dT）18引物混勻并瞬時(shí)離心，65℃5min，反應(yīng)體系：4μl反應(yīng)緩沖液，2μl鎂離子，1μl逆轉(zhuǎn)率酶，1μl RNA酶抑制劑，6μl ddH2O。反應(yīng)條件：42℃ 60min，72℃10min，4℃保存。得到的cDNA產(chǎn)物放置在－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MxA mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

采用熒光定量PCR法檢測(cè)MxA mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。以人GAPDH基因作為內(nèi)參對(duì)照，反應(yīng)體系如下（總體積為20μl）：cDNA 1μl，引物lμl，SYBR Premix Ex Taq ⅠⅠ 10μl，ROX ⅠⅠ 0.4μl，ddH2O 7.6μl。擴(kuò)增條件為95℃30s預(yù)變性；95℃20s，60℃20s，72℃35s，50個(gè)循環(huán)，溶解曲線條件：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。MxA 基因mRNA表達(dá)水平采用相對(duì)表達(dá)量表示，即ΔCt表示，ΔCt＝CtMxAmRNA－CtGAPDH。

表1 MxA mRNA和GAPDH引物序列

1.6 HCⅤ RNA載量的測(cè)定

采用 ⅤⅠⅠA7熒光定量 PCR 儀，按照 HCⅤRNA定量試劑盒的操作說(shuō)明，檢測(cè)HCⅤ RNA載量。HCⅤ RNA最低檢測(cè)限為1×103ⅠU／ml。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，不同組間均數(shù)兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組MxA mRNA表達(dá)量的比較

AHC組、CHC組、對(duì)照組MxA mRNA相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異（F＝987.57，P＜0.01）；AHC組、CHC組表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.05），CHC組MxA相對(duì)表達(dá)量高于AHC組（P＜0.05）。

2.2 各組間HCⅤ RNA載量比較

AHC組的 HCⅤ RNA載量（Log10HCⅤ＝4.37±0.85）較CHC組（Log10HCⅤ＝6.35±0.83）低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－14.36，P＜0.01）。

表2 各組MxA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組MxA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與 AHC組比較，2）P＜0.05

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2.3 MxA mRNA表達(dá)量與HCⅤ RNA載量相關(guān)性分析

AHC組MxA mRNA表達(dá)量與HCⅤ RNA載量呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.865，P＜0.001），而 CHC組MxA mRNA表達(dá)量與HCⅤ RNA載量無(wú)明顯相關(guān)性（r＝0.174，P＞0.05）。

3 討 論

HCⅤ通過(guò)多種機(jī)制逃避固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答以維持其持續(xù)感染。比如，HCⅤ NS2蛋白也被發(fā)現(xiàn)能抑制ⅠFN－α，ⅠFN－β，白細(xì)胞介素－29（ⅠL－29）和趨化因子基因的啟動(dòng)子活性［7］。除此之外，HCⅤ NS3／4A蛋白酶通過(guò)切割β干擾素TⅠR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRⅠF）和線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MA－ⅤS）［8］兩者關(guān)鍵銜接分子，使核因子－κB（NK－κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（ⅠRF3）不能激活，從而阻斷Ⅰ型ⅠFN的生產(chǎn)。

人Mx基因位于第21號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，經(jīng)Ⅰ型ⅠFN誘導(dǎo)產(chǎn)生MxA和MxB蛋白［9］。MxB蛋白目前未發(fā)現(xiàn)有抗病毒活性，而MxA蛋白具有廣譜的抗病毒效應(yīng)。MxA蛋白只有在與病毒的核糖核蛋白體中的核衣殼緊密結(jié)合后才能發(fā)生活化，活化的MxA發(fā)揮對(duì)病毒核衣殼的水解作用，阻止病毒對(duì)細(xì)胞的吸附與穿入，從而阻止病毒基因組在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制［10］，水解后釋放出來(lái)的RNA核酸很快被胞漿中的核酸內(nèi)切酶降解。也有研究［11］表明dsRNA也可作為MxA基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑。少量的病毒即可誘導(dǎo)Mx蛋白的表達(dá)，而細(xì)菌、寄生蟲(chóng)及其它微生物感染細(xì)胞并不能誘導(dǎo)Mx蛋白表達(dá)。因此，細(xì)胞中Mx蛋白表達(dá)水平的高低可以作為病毒感染的一個(gè)標(biāo)志，用來(lái)與細(xì)菌等其它微生物的感染作鑒別診斷。

據(jù)報(bào)道，在 HCⅤ急性感染早期，機(jī)體存在HCⅤ RNA 陽(yáng) 性 而 抗－HCⅤ 抗 體 陰 性 的 窗 口期［12，13］。在此窗口期，HCⅤ 核蛋白被漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（PDC細(xì)胞）內(nèi)化并抑制PDC細(xì)胞分泌ⅠFN，而當(dāng)機(jī)體形成抗HCⅤ核蛋白抗體后，PDC可能已經(jīng)在數(shù)量及功能上受到損傷［14］。這可能是宿主進(jìn)入慢性持續(xù)感染的原因。慢性HCⅤ感染患者體內(nèi)含有較高水平的核心蛋白（Core），其能增加非磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）的表達(dá)從而降低PDC分泌ⅠFN。這可能與非磷酸化的STAT1與ⅠFN受體下游的JAK／STAT受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相關(guān)［15］。最后導(dǎo)致宿主抗病毒基因表達(dá)降低。故此，尋找能早期診斷HCⅤ感染階段的靈敏指標(biāo)對(duì)預(yù)防急性HCⅤ感染進(jìn)入慢性感染具有重要臨床意義，有利于提高HCⅤ感染的治療有效率［4］。

本文結(jié)果顯示，AHC組和CHC組MxA mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組高，且AHC患者M(jìn)xA mRNA表達(dá)量與HCⅤ RNA載量呈正相關(guān)，表明機(jī)體感染HCⅤ后可通過(guò)調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗HCⅤ效應(yīng)，并且急性HCⅤ感染階段（即AHC患者）隨著病毒量的增多抗病毒基因表達(dá)增強(qiáng)，但隨著HCⅤ機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞導(dǎo)致HCⅤ感染者進(jìn)入慢性化階段［14，15］。

綜上所述，檢測(cè) MxA mRNA表達(dá)可為HCⅤ急性期的早期診斷和治療提供有價(jià)值的輔助性依據(jù)。