復(fù)方王不留行片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙建穎，盧曉梅，李亮亮，許明哲（洛陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 洛陽(yáng) 471023）

復(fù)方王不留行片是由王不留行、鄰氨基苯甲酸、干酵母、乳酸鈣組成的復(fù)方制劑，具有增強(qiáng)體質(zhì)、通經(jīng)活血、散結(jié)、下乳、消腫、消癰的功效，臨床上用于產(chǎn)后氣血虧損、乳汁不通不下或乳少及乳痛、乳腫等癥。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第十四冊(cè)WS-10001-（HD-1369）-2003未對(duì)方中主藥王不留行進(jìn)行質(zhì)量控制，文獻(xiàn)報(bào)道[1]僅見(jiàn)方中王不留行薄層色譜（TLC）鑒別方法，未見(jiàn)王不留行中王不留行黃酮苷的含量測(cè)定方法。為了有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者建立了TLC法對(duì)王不留行進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定方中鄰氨基苯甲酸及王不留行黃酮苷的含量。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括LPG-3400SD型泵、WPS-3000SL型自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000RS型柱溫箱、VWD-3100型紫外檢測(cè)器、Chromeleon色譜工作站（美國(guó)Dionex公司）；92SM-202-A-DR電子分析天平（瑞士Precisa公司）；UV-2401PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方王不留行片（白云山湯陰東泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào):130302、120606、130311、131104；焦作市博愛(ài)藥業(yè)有限公司，批號(hào):110621）。王不留行黃酮苷對(duì)照品（批號(hào):111853-201001，純度:91.7%）、王不留行對(duì)照藥材（批號(hào):121094-200703）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鄰氨基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào):C1305010，純度:99.5%）購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司；聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇為色譜純，磷酸、乙醇、無(wú)水乙醇、三氯化鋁均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 王不留行的TLC鑒別

取本品，除去糖衣，粉碎，取粉末適量（約相當(dāng)于王不留行1.0 g），置于錐形瓶中，加70%甲醇40ml，超聲（功率:200 W，頻率:40 kHz）處理30min，放冷，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取王不留行對(duì)照藥材1 g，照上述供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液。再取王不留行黃酮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取“2.2.2”項(xiàng)下缺王不留行的陰性樣品適量，照上述供試品溶液的制備方法制成缺王不留行的陰性樣品溶液。按TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以無(wú)水乙醇-水（4∶6，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，采用2%三氯化鋁乙醇溶液浸漬法顯色，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果，供試品溶液中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，缺王不留行的陰性樣品無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

圖1 薄層色譜圖1～3、7～8.5批樣品；4.王不留行黃酮苷對(duì)照品；5.王不留行對(duì)照藥材；6.缺王不留行的陰性樣品Fig 1 TLC chromatograms1-3，7-8.test sample；4.reference substance of vaccarin；5.reference substance of Vaccaria segetalis；6.negative sample without V.segetalis

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件色譜柱:YMC-Pack Pro C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇為流動(dòng)相A，0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，程序詳見(jiàn)表1；流速:1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):280nm；柱溫:35 ℃；進(jìn)樣量:10μl。

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取王不留行黃酮苷對(duì)照品30.38mg，置于50ml量瓶中，用70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為王不留行黃酮苷對(duì)照品貯備液。再精密稱(chēng)取鄰氨基苯甲酸101.08mg，置于50ml量瓶中，再精密量取上述王不留行黃酮苷對(duì)照品貯備液5ml，置于同一50ml量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液。取樣品40片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于王不留行1.0 g），置于50ml量瓶中，加70%甲醇30ml，超聲（功率:200 W；頻率:40 kHz）處理30min，放置至室溫，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。（3）陰性對(duì)照溶液。按處方比例分別稱(chēng)取除鄰氨基苯甲酸、王不留行外的其余各成分，按制備工藝分別制成缺鄰氨基苯甲酸、王不留行的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法，制成缺鄰氨基苯甲酸、王不留行的陰性對(duì)照溶液。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of the linear gradient elution

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液中鄰氨基苯甲酸和王不留行黃酮苷能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)以王不留行黃酮苷計(jì)不低于5500，分離度＞9.2；陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.缺王不留行的陰性對(duì)照；D.缺鄰氨基苯甲酸的陰性對(duì)照；1.鄰氨基苯甲酸；2.王不留行黃酮苷Fig 2 HPLC chromatogramsA.mixed reference；B.test sample；C.negative sample without V.segetalis；D.negative sample without anthranilic acid；1.anthranilic acid；2.vaccarin

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、3、5、7、10、20μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y王不留行黃酮苷＝21.56x－0.100（r＝0.9999）；y鄰氨基苯甲酸＝3.755x+1.296（r＝0.9999）。結(jié)果表明，王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸的進(jìn)樣量分別在0.0557～2.2287、2.0114～40.2279μg范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸的峰面積的RSD分別為0.97%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品（批號(hào):130302）溶液適量，分別于配制0、2、6、8、12h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸峰面積的RSD分別為0.86%、0.79%（n＝6），表明供試品溶液12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào):130302）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，樣品中王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸的平均含量分別為1.0102、32.016mg/g，RSD分別為1.01%、0.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào):130302）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于王不留行0.5 g），共6份，分別置于50ml量瓶中，分別加入鄰氨基苯甲酸對(duì)照品約50mg、“2.2.2”項(xiàng)下王不留行黃酮苷對(duì)照品貯備液3.0ml，加70%甲醇30ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取5批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密稱(chēng)取王不留行黃酮苷和鄰氨基苯甲酸對(duì)照品各適量，用70%甲醇配制成適宜濃度的溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法在200～400nm范圍內(nèi)掃描吸收光譜。結(jié)果表明，王不留行黃酮苷在280nm波長(zhǎng)處有最大吸收，鄰氨基苯甲酸在217、243nm波長(zhǎng)處均有最大吸收。由于處方中王不留行黃酮苷的含量相對(duì)較低，為使兩種成分都有較好的響應(yīng)，故選擇280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的篩選

參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-8]，本試驗(yàn)比較了多種流動(dòng)相系統(tǒng)，分離效果均不理想。最終選用甲醇-0.3%磷酸溶液作為流動(dòng)相，通過(guò)優(yōu)化，使樣品中鄰氨基苯甲酸與王不留行黃酮苷色兩組分達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾，且各組分分離度良好，峰形佳。

3.3 耐用性考察

本文考察了YMC-Pack Pro C18（250mm×4.6mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo Syncronis C18（150mm×4.6mm，5 μm）等色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物分離度和含量測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，3個(gè)不同廠家的同類(lèi)型色譜柱對(duì)樣品含量測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著影響，含量測(cè)定RSD＜2.8%，分離度均＞3.4。

3.4 TLC鑒別中展開(kāi)系統(tǒng)和溫度的考察

筆者曾采用甲醇-水（4∶6，V/V）、甲醇-水（1∶1，V/V）等展開(kāi)系統(tǒng)對(duì)方中王不留行進(jìn)行TLC鑒別，但陰性對(duì)照樣品均有干擾，效果不佳。最終采用無(wú)水乙醇-水（4∶6，V/V）的展開(kāi)系統(tǒng)，該方法陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾，斑點(diǎn)清晰，分離度好。試驗(yàn)中筆者還發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)樣品的分離度有較大影響，溫度高時(shí)陰性樣品干擾大，斑點(diǎn)分離度差，因此TLC鑒別時(shí)應(yīng)控制溫度在20℃以下。

3.5 含量測(cè)定結(jié)果分析

由本研究結(jié)果可知，不同廠家樣品中王不留行黃酮苷的含量相差極大，且低于2010年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]中對(duì)王不留行藥材最低限量（0.40%）的規(guī)定。分析原因，主要是由于原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)王不留行質(zhì)量控制，廠家投料用飲片含量差異所致。為了更好地控制復(fù)方王不留行片的質(zhì)量，保證用藥安全、有效，有必要建立王不留行黃酮苷的含量控制標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為復(fù)方王不留行片的質(zhì)量控制方法。

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