頭孢他啶在銅綠假單胞菌慢性肺部感染大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

于 歆，徐 輝，王詩(shī)琪，李曉冰，何曉靜，菅凌燕

·藥學(xué)研究·

頭孢他啶在銅綠假單胞菌慢性肺部感染大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

于 歆，徐 輝，王詩(shī)琪，李曉冰，何曉靜，菅凌燕*

目的建立銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)慢性肺部感染大鼠模型，采用高效液相色譜法(High performance liquild chromatography，HPLC)法測(cè)定頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)在其體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。方法血漿樣品經(jīng)含0.1%甲酸的乙腈沉淀蛋白后，采用ZORBAX SB-C18色譜柱分離，流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05 % 甲酸) (15∶85，v/v)，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果CAZ在3～150 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好；方法的日間和日內(nèi)精密度均小于6.4 %，穩(wěn)定性良好，Cmax為(47.86±10.40) μg/mL，t1/2為(0.4±0.1) h，AUC0-6為(28.80±10.67) μg·h/mL。CAZ在銅綠假單胞菌慢性肺部感染大鼠模型的藥動(dòng)學(xué)特征提示，其體內(nèi)過程符合一級(jí)吸收二室模型。結(jié)論所建立的HPLC分析方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性高，可用于銅綠假單胞菌慢性肺部感染大鼠體內(nèi)的頭孢他啶藥代動(dòng)力學(xué)研究。

頭孢他啶；銅綠假單胞菌；藥代動(dòng)力學(xué)；HPLC

0 引言

頭孢菌素類抗生素具有廣譜的抗菌特性和較強(qiáng)的耐酸性，常與氨基糖苷類合用達(dá)到良好的殺菌作用[1]。頭孢菌素類抗生素根據(jù)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性及腎毒性的不同可以分為4類[2]。頭孢他啶是第3代頭孢菌素類抗生素，對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)具有較強(qiáng)的抗菌作用，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定[3]。PA是耐藥性較強(qiáng)的致病菌，易導(dǎo)致肺炎/尿路感染等疾病[4]。其產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要為β-內(nèi)酰胺酶的生成和外排泵的表達(dá)[5]。對(duì)PA有抑制作用的有氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類及β-內(nèi)酰胺類等[6]。頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)是治療PA感染的一線用藥，近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了多項(xiàng)CAZ在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[7-8]，但并無在PA慢性肺部感染大鼠體內(nèi)的CAZ藥代動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道。因此，本研究擬建立PA慢性肺部感染大鼠模型，采用高效液相色譜(HPLC)法，測(cè)定PA慢性肺部感染大鼠口服給予CAZ后的經(jīng)時(shí)血藥濃度，估算相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)CAZ在PA慢性肺部感染大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)特征，為臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑 頭孢他啶粉針(復(fù)達(dá)欣，葛蘭素史克)；CAZ對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130484，含量85.7%)；對(duì)乙酰氨基酚(AP)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100018，含量99%)；甲醇、乙腈(均為色譜純，美國(guó)Fisher公司)；醋酸銨、甲酸(均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為去離子水。試劑使用前均經(jīng)過0.45 μm微孔濾過膜過濾。

1.2 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(含G1311B四元泵，G1329B進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314F紫外檢測(cè)器)；Thermo渦旋混合器；高速離心機(jī)(Eppendof Centrifuge5430R)；離心濃縮儀(Thermo Scientific SPD1010/SPD2010)。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重150～170 g；合格證號(hào)：SCXK[京]2014-0004，由我院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 菌株 臨床分離PA菌株，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。該P(yáng)A菌株是對(duì)規(guī)定藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物均敏感的臨床分離株。

2 方法與結(jié)果

2.1 PA肺部感染大鼠模型的建立 參照本實(shí)驗(yàn)室[9]建立的方法，采用無創(chuàng)氣管插管方法接種實(shí)驗(yàn)大鼠，建立慢性肺部感染大鼠模型。以大鼠肺勻漿細(xì)菌培養(yǎng)出PA細(xì)菌及病理學(xué)改變檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒Α?/p>

2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent Technologies)；流動(dòng)相∶甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.05 % 甲酸) (15∶85，v/v)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 溶液的制備 分別精密稱取CAZ對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)(AP)對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的各儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱中保存待用。臨用前用純水精密稀釋頭孢他啶儲(chǔ)備液，制備成30、60、100、300、600、1 000 μg/mL的頭孢他啶工作液。

2.4 血漿樣本的預(yù)處理 精密吸取200 μL大鼠血漿樣品，置于1.5 mL的EP管，加入內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液20 μL (400 μg/mL)，渦旋30 s。緩慢加入乙腈(含0.1%甲酸) 600 μL，渦旋5 min，靜置5 min后，15 600 r/min離心10 min后取上清，移入另1個(gè)1.5 mL的EP管中，放入離心濃縮儀中蒸干，將殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋5 min，于15 600 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量20 μL。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性研究 CAZ和內(nèi)標(biāo)AP色譜峰峰形良好，分離度高，無雜峰干擾測(cè)定，基線平穩(wěn)。本方法選擇性好，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中CAZ的濃度，且靈敏度較高，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾CAZ和內(nèi)標(biāo)AP的測(cè)定，CAZ、AP的保留時(shí)間分別約為7.8、5.2 min。

2.5.2 線性范圍與定量下限 取1.5 mL離心管數(shù)支，分別精密加入不同濃度的CAZ對(duì)照品溶液20 μL后以氮?dú)饬鞔蹈?，加入空白血漿200 μL，旋渦混勻，配成含CAZ濃度分別為3、6、10、30、60、100、150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“2.4”項(xiàng)下操作，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并同時(shí)制備空白樣品，進(jìn)行HPLC-UV分析，記錄色譜圖。以血漿中待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)，應(yīng)用加權(quán)最小二乘法(W=1/χ2)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：f=0.010 2 C+0.006 9，r2=0.999 9。結(jié)果顯示，CAZ在3～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限均為3 μg/mL。

2.5.3 精密度、準(zhǔn)確度及回收率 制備含CAZ濃度分別為5、50、120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品，每個(gè)濃度平行配制5份，并配制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“2.4”項(xiàng)下操作，共配制3個(gè)分析批，記錄色譜圖，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f，代入當(dāng)批的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得實(shí)測(cè)濃度及實(shí)測(cè)濃度準(zhǔn)確度，計(jì)算日間、日內(nèi)精密度及回收率，結(jié)果見表1。

表1 大鼠血漿中CAZ的精密度、準(zhǔn)確度及回收率(%)

注：RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RE為相對(duì)誤差

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制CAZ低、中、高3種不同濃度(5、50、120 μg/mL)含藥血漿適量，每種濃度分取12份，每份200 μL。3份于配制好后按“2.4”項(xiàng)下操作立即分析，并在測(cè)定完成后，在進(jìn)樣器樣品盤中放置12 h后再次進(jìn)樣分析；3份于室溫放置11 h；3份于配制好后反復(fù)凍融3次；3份于配制好后放入-20 ℃冰箱中冷凍保存4周后取出解凍，均按“2.4”項(xiàng)下操作分析。由相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出各樣品的濃度，計(jì)算測(cè)得濃度平均值。結(jié)果表明，CAZ血漿樣品在室溫下放置11 h、進(jìn)樣器中放置12 h、反復(fù)凍融3次及冰凍放置4周條件下均穩(wěn)定性良好。

2.5.5 PA慢性肺部感染大鼠CAZ的藥代動(dòng)力學(xué)研究 取已造模成功的大鼠6只，禁食12 h，稱重后分別尾靜脈注射CAZ溶液90 mg/kg，并于給藥前及給藥后5、15、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h經(jīng)大鼠眼底靜脈叢取全血0.5 mL。將全血立即置于已預(yù)涂肝素的EP管，5 000 r/min，離心10 min。分離上清液，置-20 ℃避光保存待測(cè)。PA慢性肺部感染大鼠尾靜脈注射給予CAZ溶液90 mg/kg后，CAZ的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。采用DAS 2.0軟件計(jì)算CAZ的PK參數(shù)。達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(tmax)采用實(shí)測(cè)值，AUC0～t采用梯形法計(jì)算，AUC0～∞按公式AUC0～∞=AUC0～t+Clast/ke計(jì)算，Clast為最后一個(gè)可測(cè)得時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，ke為表觀末端消除速率參數(shù)。以半對(duì)數(shù)作圖法，由消除相的4個(gè)濃度點(diǎn)計(jì)算ke消除半衰期(t1/2)，t1/2=0.693/ke。見表2。

圖1 CAZ的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)

表2 CAZ的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用無創(chuàng)氣管插管法接種PA藻酸鹽包被體建立大鼠PA慢性肺部感染模型，成功率為100%。采用HPLC-UV法測(cè)定頭孢他啶血藥濃度，具有方便快速、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先建立PA慢性肺部感染模型，研究頭孢他啶在此動(dòng)物模型的藥動(dòng)學(xué)特征。本實(shí)驗(yàn)采用0.05%甲酸的5 mmol/L醋酸銨緩沖液∶甲醇(85∶15，v/v)為流動(dòng)相，方法重現(xiàn)性好，峰形良好且頭孢他啶與內(nèi)標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚兩峰分離度>1.5。與常用磷酸二氫鉀[10]作為流動(dòng)相相比，具有流動(dòng)相簡(jiǎn)單且pH值影響小等特點(diǎn)。考察血漿樣品處理方法，實(shí)驗(yàn)前期采用甲醇作為沉淀劑，提取回收率低。采用乙腈作為沉淀劑，由于乙腈對(duì)蛋白的包裹作用，造成樣品測(cè)定重復(fù)性差。經(jīng)試驗(yàn)，采用含0.1%甲酸的乙腈作為沉淀劑，沉淀效果好，回收率高且重復(fù)性好。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)銅綠假單胞菌慢性肺部感染模型尾靜脈注射頭孢他啶后體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行研究，其體內(nèi)過程符合一級(jí)吸收二室模型，與健康大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征[11]無明顯差別。

[1] 康慶.頭孢菌素類抗生素的藥理特性及臨床應(yīng)用分析[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2016,11(13):3-5.

[2] 郭嵐,馬麗梅,張發(fā)明.頭孢菌素類抗菌藥物研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué),2015,12(9):74-75.

[3] 易林高,李佳,林潔,等.頭孢菌素類抗生素的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用[J].海峽藥學(xué),2010,22(3):159-161.

[4] Sherwin CM,Kiang TK,Spigarelli MG,et al.Fundamentals of population pharmacokinetic modelling:validation methods[J].Clin Pharmacokinet,2012,51(9):573-590.

[5] 李炳玲.銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].抗感染藥學(xué),2014,11(3):182-186.

[6] 伏添.左氧氟沙星聯(lián)合羅紅霉素治療呼吸道銅綠假單胞菌感染[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2011,22(10):1248-1249.

[7] 孫路路,單愛蓮,呂媛.注射用頭孢他啶/他唑巴坦(5∶1)在中國(guó)健康人體的多次給藥的藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2013,29(9):669-671.

[8] 梁健成,王芳芳,黃義昆,等.HPLC法測(cè)定微泵給藥后頭孢他啶血藥濃度[J].中國(guó)藥師,2008,11(11):1293-1294.

[9] 宋方,菅淩燕.銅綠假單胞菌對(duì)左氧氟沙星耐藥分子機(jī)制研究[D].沈陽(yáng):中國(guó)醫(yī)科大學(xué),2015.

[10]方娟娟,余衛(wèi)平,邢艷霞,等.高效液相色譜法測(cè)定人血清中頭孢他啶的濃度[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2004,23(6):388-390.

[11]夏東亞,郭濤,陳巖,等.高效液相色譜法測(cè)定頭孢他啶血藥濃度[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(1):41-43.

PharmacokineticsofceftazidimeinratswithchronicpulmonaryinfectioninducedbyPseudomonasaeruginosa

YU Xin,XU Hui,WANG Shi-qi,LI Xiao-bing,HE Xiao-jing,JIAN Ling-yan*

(Department of Pharmacy,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

ObjectiveTo develop an HPLC method for determination of ceftazidime (CAZ) in rats′ plasma samples,and investigate the pharmacokinetic parameters with CAZ in rats with chronic pulmonaryPseudomonasaeruginosa(PA) infection.MethodsThe plasma samples were precipitated by acetonitrile,which contained 0.05% formic acid,and then it was separated on a 35 ℃ ZORBAX SB-C18column with a mobile phase of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate buffer solution containing 0.05% formic acid (15∶85,v/v),at a flow rate of 1 mL/min.The detection wavelength was 254 nm.ResultsThe method exhibited good linearity within the concentration range of 3～150 μg/mL.The values on both occasions (intra- and inter-day) were all within 6.4%,and CAZ was stable in rat plasma under different storage conditions.The Cmaxwas (47.86±10.40) μg/mL,thet1/2was (0.4±0.1) h,and the AUC0-6was (28.80±10.67) μg·h/mL.The pharmacokinetic characteristics of CAZ in PA chronic pulmonary infectious model of rats showed that they were in line with the two-compartment model with first order absorption.ConclusionThe developed HPLC method is accurate,sensitive and reproducible,it is suitable for the pharmacokinetic study of CAZ in the PA chronic pulmonary infected rat.

Ceftazidime;Pseudomonasaeruginosa;Pharmacokinetics;HPLC

2016-12-10

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng) 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201710020