過表達枸杞LmPSY基因提高洋桔?？鼓嫘缘难芯?/h1>
2015-05-16 03:53:18曹海燕李招娣武衛(wèi)黨
天津大學學報(自然科學與工程技術版) 2015年3期
季 靜，曹海燕，王 罡，柳 潔，李招娣，武衛(wèi)黨
(1. 天津大學化工學院，天津 300072；2. 天津大學遺傳工程研究所，天津 300072)
過表達枸杞LmPSY基因提高洋桔?？鼓嫘缘难芯?/p>
季 靜1,2，曹海燕1，王 罡2，柳 潔1，李招娣1，武衛(wèi)黨2
(1. 天津大學化工學院，天津 300072；2. 天津大學遺傳工程研究所，天津 300072)
類胡蘿卜素與植物的光保護及耐鹽有很大關系，八氫番茄紅素合成酶(PSY)是類胡羅素合成重要酶．將來自枸杞(Lycium chinense Miller)的八氫番茄紅素合成酶(LmPSY)基因在洋桔梗中過表達，旨在提高其抗逆性．RT-qPCR結果發(fā)現(xiàn)LmPSY基因在轉基因洋桔梗中有組織差異表達．高效液相色譜結果說明轉基因洋桔梗葉片總類胡蘿卜素提高 1.3倍，玉米黃質(zhì)和葉黃素含量提高 1.1倍．強光脅迫條件下，轉基因洋桔梗鮮重和干重較非轉基因植株有顯著提高．200,mmol/L氯化鈉脅迫條件下，轉基因洋桔梗過氧化物酶(POD)和超氧化物酶(SOD)含量有顯著提高，轉基因植株的熒光參數(shù)(Fv/Fm)提高 8.0%～9.3%．強光和鹽脅迫條件下對轉基因植株生理生化指標的測定證明洋桔梗的耐強光性及耐鹽性有顯著提高．
洋桔梗；八氫番茄紅素合成酶基因；耐強光性；耐鹽性
洋桔梗(Eustoma grandiflorum)別名草原龍膽，有綠色、白色、紫色、紅色、粉色等花色．原產(chǎn)于北美洲，后引種至日本和歐洲，經(jīng)過雜交改良后成為異常新奇、妖媚動人的花卉[1-2]．自 1982年推出單瓣的海地系列和重瓣的回音系列以來，洋桔梗的銷售量急劇增加．目前，年銷售量達到 1×108支，年銷售額1.1×108美元，列切花排名第7位[3]．洋桔梗適宜在溫暖、濕潤和陽光充足的地區(qū)種植，是一種較耐寒、不耐鹽和強光照射的植物．而天津市為重鹽堿城市，土壤鹽漬化嚴重，鹽堿地綠化難度大，而且夏季強光照射較嚴重，因此無法大面積種植洋桔梗．于是研究人員開始培育新的洋桔梗品種增強其抗逆性，目前普遍認為植物基因工程的手段速度快并且見效快[4]，已經(jīng)利用植物基因工程手段培育了大豆、玉米、番茄、小麥等許多植物的抗逆性較強的新品種[5-7]．關于洋桔梗基因工程的研究大都是關于花色及花香的研究，2004年我國學者毛元榮等[8]將類黃酮途徑相關基因NPRI通過農(nóng)桿花色菌介導法導入洋桔梗中，研究其花色的改變，2007年Aranovich等[9]將來自仙女扇的BEAT基因?qū)胙蠼酃＃瑢ζ浠ㄏ阕兓M行了研究.關于通過基因工程手段增強洋桔?？鼓嫘缘难芯坎⒉皇呛芏?，2012年本研究室 Wu等[10]通過農(nóng)桿菌介導法將與類胡蘿卜素相關基因AtchyB導入洋桔梗發(fā)現(xiàn)洋桔梗耐強光性有顯著提高．
在類胡蘿卜素生物合成途徑上游，兩分子的牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(GGPP)在八氫番茄紅素合成酶(PSY)的作用下形成一種復雜的類胡蘿卜素——八氫番茄紅素，經(jīng)過后續(xù)幾步反應可以形成 ABA (abscisic acid)[11]. 關于類胡蘿卜素生物合成的研究已經(jīng)比較清楚．由于類胡蘿卜素鑲嵌于葉綠體和有色體膜中，它們消除活性氧，淬滅活性的三重態(tài)分子、單線態(tài)氧，抑制有害自由基的形成，防止植物的光滅活和光破壞，并參與消耗過剩光能的反應，與光保護的作用相關[12]．而脫落酸是植物體內(nèi)的脅迫相關激素，在介導植物抗逆信號應答過程中起著重要作用，在鹽堿及干旱條件下，植物內(nèi)源ABA水平會提高．自2008年Li等[13]發(fā)現(xiàn)玉米中的PSY3基因轉錄水平與非生物脅迫相關，表明 PSY基因與非生物脅迫抗性相關后，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)將鹽角草 PSY基因在擬南芥中過表達，可以提高擬南芥的抗非生物脅迫能力[14]，將葡萄柚果實中的 PSY基因在煙草中過表達可以提高煙草的抗非生物脅迫能力[15]．
筆者運用農(nóng)桿菌轉化法，將從枸杞中分離的八氫番茄紅素合成酶基因(LmPSY)轉入 Green品種洋桔梗中，進行強光和鹽脅迫處理，并且對其生理生化指標進行了測定[16-17]．旨在培育出具有耐強光、耐鹽堿的洋桔梗品種，適宜在天津這樣土地鹽堿化較嚴重并且有強光直射的地區(qū)種植，從而擴大洋桔梗的種植范圍，培育出更多洋桔梗以滿足市場需求．
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 植物材料
Green品種的洋桔梗．
1.1.2 質(zhì)粒載體和農(nóng)桿菌菌株
本實驗所用質(zhì)粒載體為本實驗室(天津大學遺傳工程研究所)保存的植物雙元表達質(zhì)粒載體pCAMBIA2300，含有卡那霉素抗性基因質(zhì)粒圖譜見圖 1．本實驗所用根癌農(nóng)桿菌株為本實驗室保存的含有pCAMBIA2300-LmPSY質(zhì)粒的C58菌株．
圖1 pCAMBIA2300-LmPSY載體圖譜Fig.1 Schematic representation of plasmid pCAMBIA2300-LmPSY
1.1.3 培養(yǎng)基
培養(yǎng)基成分及種類見表1.
表1 培養(yǎng)基Tab.1 Medium formulation
1.2 洋桔梗遺傳轉化
1.2.1 外植體
將洋桔梗種子滅菌后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，待其長出4～5片葉子時，取葉片將其切成0.5,cm2大小的葉盤備用．
1.2.2 農(nóng)桿菌浸染液的制備
挑取Kana(質(zhì)量濃度為100,mg/L)的YEP固體培養(yǎng)基上生長的單菌落至Kana濃度相同的50,mL YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至 OD600值為 0.6～0.8，3,800,r/min離心3,min收集菌體，用相同體積農(nóng)桿菌重懸液重懸菌體，作為浸染液[10,18]．
1.2.3 洋桔梗葉盤的浸染轉化
將上一步中制得的農(nóng)桿菌浸染液轉移至盛有洋桔梗葉盤的無菌三角瓶中，浸泡 15,min，將洋桔梗葉盤接種至共培培養(yǎng)基，于22,℃暗培養(yǎng)3,d．
將共培后的洋桔梗葉盤從共培培養(yǎng)基上轉移至篩選培養(yǎng)基，每2周繼代1次，頭孢霉素的質(zhì)量濃度由400,mg/L逐漸降低至100,mg/L，葉盤邊緣長出愈傷組織后，將愈傷組織塊切下，接種至新的篩選培養(yǎng)基．
1.2.4 不定芽的生根與移栽
當抗性不定芽高度超出 3,cm后，將其切下，放入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)．待不定芽的根伸長至 4,cm左右時將其移栽至含有蛭石、珍珠巖和營養(yǎng)土的花盆中．待洋桔梗結種子后，收取種子在 Kana(質(zhì)量濃度為50,mg/L)的1/2,MS培養(yǎng)基中萌發(fā)，待植株到四葉期時移栽至花盆中進行后續(xù)研究．
1.3 轉基因洋桔梗分子檢測與表達分析
1.3.1 轉基因洋桔梗分子的檢測
(1) 抗性植株的PCR檢測. 采用CTAB法提取對照和抗性植株基因組DNA，根據(jù)LmPSY基因設計引物PSYF、PSYR，進行PCR檢測．
(2) 轉基因植株的RT-PCR檢測. 采用Trizol法提取對照和轉基因植株葉片總 RNA，用天根公司TransScript TransStartTM one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄合成的cDNA第一鏈作為模板．用引物PSYF和PSYR檢測LmPSY基因的表達．根據(jù)洋桔梗泛素合成酶基因(EgUBi，作為內(nèi)參)設計引物 EgUbiF、EgUbiR進行 RT-PCR檢測．引物序列見表2．
表2 引物序列Tab.2 Primer sequences
1.3.2 實時定量PCR檢測轉基因洋桔梗組織差異表達
用軟件primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer 3/)設計熒光定量 PCR引物：PSYQPCRF、PSYQPCRR.仍然用泛素合成酶基因作內(nèi)參基因，其引物仍然用EgUbiR 和 EgUbiF．用 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN，德國)分別提取轉基因洋桔梗根、莖、新葉、老葉總RNA，合成cDNA第一鏈方法見RT-PCR檢測．用Top Green qPCR SuperMix(TRANS，中國)做實時定量 PCR檢測，反應體系為：PSYQPCRF (10,μmol/L)0.5,μL，PSYQPCRR (10 μmol/L)0.5 μL，2×TransStartTMTop Green qPCR SuperMix 12.5,μL， passive Reference Dye 0.5,μL，cDNA 1,μL．反應條件為 94,℃ 30,s，94,℃ 5,s，60,℃ 15,s，72,℃ 10,s，40個循環(huán)．
1.3.3 類胡蘿卜素含量檢測
(1) 總類胡蘿卜素的提取及檢測．稱取 0.2,g新鮮洋桔梗葉片轉移至離心管中，用組織研磨器進行研磨之后加入2,mL 60% KOH和20,mL甲醇劇烈振蕩混勻，60,℃水浴 20,min，用 15,mL含有 50%乙醚的石油醚作為萃取劑萃取總類胡蘿卜素．將提取的類胡蘿卜素溶于丙酮，用紫外分光光度計測定樣品在450,nm 處的吸光值，葉片中總類胡蘿卜素含量計算式為
式中：X為總類胡蘿卜素含量，μg/g；A為樣品在450,nm 處的吸光度；V為提取液的體積；ε 為類胡蘿卜素分子平均消光系數(shù)，2,100；m為稱取的洋桔梗葉片質(zhì)量，g．
(2) 洋桔梗葉片色素的高效液相色譜分析．將樣品溶于60,μL丙酮，取20,μL進樣進行高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography，HPLC).流動相為異丙醇、乙腈和甲醇，體積比為 5∶85∶10．使用Thermo二極管陣列檢測器全波長掃描類胡蘿卜素譜圖．
1.3.4 表型的變化
類胡蘿卜素是植物重要的色素物質(zhì)之一，由于植物不同組織中類胡蘿卜素各成分組成的不同，使植物莖、葉、花和果實等呈現(xiàn)不同的顏色．PSY基因是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶基因，PSY基因的過表達往往會引起一些下游代謝產(chǎn)物(如玉米黃質(zhì)和葉黃質(zhì)等)的積累量發(fā)生變化，從而導致植物的表型發(fā)生變化．
1.3.5 光脅迫洋桔梗
將長勢相同的L1品系、L4品系、非轉基因植株分為2組，每組中每個品系設置3個重復．其中一組為實驗組，另一組為對照組．對照組在正常光照條件(180,μmol/(m2·s))下培養(yǎng)，實驗組置于弱光照(75,μmol/(m2·s))條件下培養(yǎng)，1周后，測葉片的干重與鮮重比(mD/mF)．然后，將實驗組在正常光照條件下培養(yǎng) 1周后，在強光(1,000,μmol/(m2·s))脅迫下培養(yǎng)6周，測量mD和mF．mD和mF的測定方法參見文獻[10]．
1.3.6 200,mmol/L氯化鈉處理洋桔梗
采用200,mmol/L的氯化鈉對轉基因洋桔梗和非轉基因型洋桔梗施以脅迫 20,d后，測定其熒光參數(shù)(Fv/Fm)，并且取葉片，提取細胞可溶性蛋白，測定其超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性．用光合儀(LI-6400,XT)對熒光參數(shù)進行測定．SOD、POD、CAT的測定分別使用南京建成生物工程研究所的試劑盒：A001-1超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(測總 SOD)；A084-2過氧化物酶(POD)測定試劑盒；A007-1 過氧化氫酶(CAT)測試盒．
2 結果與分析
2.1 LmPSY基因在洋桔梗中的表達分析
(1) 提取抗性和非轉基因型洋桔?；蚪M DNA為模板，以引物PSYF和PSYR做PCR檢測，并以質(zhì)粒pCAMBIA2300-LmPSY為陽性對照，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR檢測結果如圖2所示．結果表明有 4個細胞系出現(xiàn)目的條帶(1,341,bp)．分別將其標記為品系L1、L2、L3和L4和進行后續(xù)研究．
圖2 洋桔梗葉片基因組PCR檢測結果Fig.2 Result of PCR assay of eustoma leaf genome
(2) 對PCR檢測呈陽性的4個細胞系和未轉化植株進行 RT-PCR檢測，4個細胞系 L1、L2、L3、L4都擴增出泛素合成酶基因并且擴增出與目的基因大小相同的片段，而非轉基因型植株未擴增出相應目的條帶，如圖3所示．
圖3 RT-PCR檢測LmPSY表達Fig.3 RT-PCR assay of LmPSY expression
2.2 實時定量PCR檢測轉基因植株不同組織表達
圖4 通過實時定量 PCR測定轉基因洋桔梗不同組織的LmPSY相對表達量Fig.4 Real-time quantitative PCR analysis of LmPSY relative expression in different eustoma tissues
2.3 轉基因植株的HPLC檢測
分別測定非轉基因型和轉基因洋桔梗葉片中的類胡蘿卜素含量．用吸光度法測得轉基因洋桔梗品系 L1和 L3葉片中總類胡蘿卜素含量分別為58.1,μg/g和 59.0,μg/g，非轉基因型洋桔梗葉片中總類胡蘿卜素含量為 46.5,μg/g，L1和 L3總類胡蘿卜素含量分別提高了 25.0%和 26.9%．β類胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素是綠色葉片中的主要類胡蘿卜素，LmPSY是類胡蘿卜素生物代謝途徑中的關鍵酶，它的過量表達使轉基因洋桔梗葉片中的玉米黃質(zhì)和葉黃素含量與非轉基因型洋桔梗相比都有顯著提高.如表3所示．
表3 轉基因洋桔梗葉片類胡蘿卜素含量Tab.3 Leaf carotenoid compositions of transgenic eustoma leaves
2.4 轉基因洋桔梗表型的變化
在洋桔梗中過表達 LmPSY基因后，其表型的改變?nèi)鐖D5所示．由圖可以看出轉基因洋桔梗葉片的葉型和顏色與非轉基因洋桔梗有所不同，轉基因洋桔梗的葉片較寬厚，并且葉片中鑲嵌的黃色部分較多[10]．
圖5 轉基因洋桔梗葉片的變化Fig.5 Changes in transgenic eustoma leaves
2.5 光脅迫條件下生理指標的測定
弱光(75,μmol/(m2·s))條件下，測葉片的干重與鮮重比(mD/mF)結果如圖 6所示，在低光照條件下轉基因植株的mD/mF明顯比野生型植株的高，在正常光照下(180,μmol/(m2·s))轉基因比非轉基因的mD/mF略有提高，但差異并不顯著．
將實驗組在強光(1,000,μmol/(m2·s))脅迫下培養(yǎng) 6周后，其生物量測量情況如圖 7所示，結果顯示，光脅迫對非轉基因植株生物量的影響比對轉基因型植株影響大，強光脅迫下非轉基因型植株mF和mD分別是正常光照下的54%和58%．而光脅迫下兩個品系L1和L4的轉基因植株的mF和mD分別為正常光照條件下的 89%、88%和 86%、85%．這也進一步驗證 LmPSY基因在提高植物抗強光和弱光脅迫中有作用.
圖6 弱光和正常光照條件下非轉基因植株和轉基因植株葉片的mD/mFFig.6 Ratio of dry mass to fresh mass(mD/mF)of wildtype (WT)and transformants L1 and L4 under low light and normal light conditions
圖7 強光和正常光照條件下非轉基因植株和轉基因植株的干重和鮮重Fig.7 Fresh mass(mF)and dry mass(mD)of wild-type (WT)and transformants L1 and L4 under high light and normal light condition
2.6 鹽脅迫后生理指標的測定
(1) 抗氧化物酶活性 SOD、POD的測定結果如圖8所示，在正常生長條件下，非轉基因型與轉基因的SOD、POD值沒有差異，SOD為56.9～64.2,U/mg，POD為 64.9～67.2,U/mg．鹽脅迫條件下，非轉基因型SOD提高到86.2,U/mg，L3提高到133.5,U/mg，非轉基因型 POD提高到 96.1,U/mg，L3提高到161.8,U/mg．而未檢測到CAT活性．
圖8 抗氧化物酶活性Fig.8 Antioxidant enzyme activity
(2) 由于逆境脅迫對光合作用各過程產(chǎn)生的影響可通過體內(nèi)葉綠素熒光誘導動力學變化反映．因此，葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm)可作為逆境條件下植物抗逆反應指標之一．Fv/Fm反映最大光化學量子產(chǎn)量，反映 PSⅡ反應中心光能轉換效率．在正常生長條件下，測得轉基因植物與非轉基因植物 Fv/Fm并無差異，皆為 0.83．為確定轉基因植物對鹽脅迫的適應能力，筆者測定L1、L2、L3 3個品系洋桔梗鹽脅迫后的Fv/Fm，結果如表4所示．在鹽脅迫條件下，對照和轉基因洋桔梗的Fv/Fm都有所降低．但在鹽脅迫條件下，3個品系轉基因洋桔梗的Fv/Fm分別為0.81、0.82及 0.81；而對照為 0.75，轉基因植株比非轉基因型植株的Fv/Fm提高了8.0%～9.3%．
表4 鹽脅迫條件下洋桔梗的Fv/Fm值Tab.4 Fv/Fmunder salt treatment
3 討 論
Giuliano等[19]報道番茄 PSY基因表達是相對恒定的，在葉子成熟過程中 PSY基因表達下調(diào)．Salvini等[15]研究向日葵發(fā)現(xiàn)HAPSY表達在葉子成熟過程中是受到調(diào)控的．而本研究發(fā)現(xiàn)轉基因洋桔梗老葉較新葉表達量高，與Salvini結論相符．
1999年 G?tz等[20]將來自細菌的八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(ChyB)轉化入藻青菌 Synechococcus PCC794中，使該菌株能夠積累高含量的 β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)，經(jīng)紫外線處理后，發(fā)現(xiàn)轉基因藻清菌 Synechococcus PCC7942的抗紫外輻射的能力有很大提高，同時發(fā)現(xiàn)內(nèi)生玉米黃質(zhì)較β-類胡蘿卜素抗紫外線更有效．2002年，G?tz等[21]為了研究類胡蘿卜素在植物光脅迫中的作用，將來自細菌的 CrtZ基因通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草中，使煙草中玉米黃質(zhì)積累量增加，從而提高煙草對紫外線輻射的抗性．2006年 Schafer等[22]研究發(fā)現(xiàn)在藻青菌 Synechococcus PCC7942中強光刺激下類胡蘿素生物合成上調(diào). 2014年本研究室 Zhao等[23]將來自擬南芥中的 chyB基因轉入煙草，發(fā)現(xiàn)煙草中葉黃素含量提高后改善了其 UV抗性．本研究中強光脅迫洋桔梗后，發(fā)現(xiàn)轉基因植株較非轉基因型植株受影響小，而非脅迫條件下 HPLC分析結果顯示轉基因洋桔梗中玉米黃質(zhì)和葉黃素含量更高．所以有可能是因為玉米黃質(zhì)和葉黃素的提高，葉黃素循環(huán)池被放大可以進一步提高植物的抗強光能力．由此可以推斷本研究中的洋桔梗的UV抗性也可能有所提高，筆者將會對其進行進一步研究．
在鹽脅迫過程中，開始用100,mmol/L、200,mmol/ L、300,mmol/L和 500,mmol/L NaCl脅迫洋桔梗發(fā)現(xiàn)，300,mmol/L NaCl以上濃度洋桔梗生長緩慢，不適宜測定生理數(shù)據(jù)，因此選擇200,mmol/L NaCl進行脅迫．Han等[13]于2008年在擬南芥中高表達鹽角草PSY基因，在 100,mmol/L NaCl脅迫下，發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥比非轉基因型擬南芥的 Fv/Fm提高 9.3%～ 16.6%．而本研究中發(fā)現(xiàn)在洋桔梗中過表達枸杞 PSY基因，在 200,mmol/L NaCl脅迫下，轉基因植株比非轉基因型植株的Fv/Fm提高8.0%～9.3%. Salvini等[15]證明 PSY對于植物在脅迫條件下合成 ABA非常重要，本研究中枸杞 LmPSY基因提高植物的耐鹽能力較顯著，可能是由于在鹽脅迫條件下，LmPSY基因過表達提高了植物中合成的ABA．
Salvini等[15]的研究表明將葡萄柚果實中的 PSY基因在煙草中過表達可以提高煙草的耐干旱能力，本研究未對轉基因植物進行干旱脅迫，在接下來的工作中會進一步研究轉LmPSY基因洋桔?？垢珊的芰κ欠裼兴岣撸?/p>
雖然洋桔梗有白色、綠色、紫色、粉色多種花色，但市場對于深黃色或橙色洋桔梗需求仍然很大．到目前為止，并沒有通過傳統(tǒng)育種或轉基因方法得到黃色洋桔梗．本研究中 LmPSY基因也可以引起花中類胡蘿卜素的積累，產(chǎn)生黃綠色花．本研究中共得到 4個細胞系，L1有10株，L2有8株，L3有7株，L4有10株．接下來將會進一步研究是否可以得到穩(wěn)定遺傳黃綠色抗逆洋桔梗，以滿足市場需求．
4 結 語
本研究將來自枸杞的LmPSY基因成功在洋桔梗中過表達．高效液相色譜結果發(fā)現(xiàn)轉基因洋桔梗葉片總類胡蘿卜素提高1.3倍，玉米黃質(zhì)和葉黃質(zhì)含量提高 1.1倍．強光脅迫條件下，轉基因洋桔梗鮮重和干重較非轉基因植株有顯著提高．200 mmol/L氯化鈉脅迫條件下，轉基因洋桔梗過氧化物酶(POD)和超氧化物酶(SOD)含量有顯著提高，轉基因植株的熒光參數(shù)(Fv/Fm)提高 8.0%～9.3%．強光和鹽脅迫條件下對轉基因植株生理生化指標的測定證明洋桔梗的耐強光性及耐鹽性有顯著提高．本研究為類胡蘿卜素生物合成途徑中相關酶基因可以用來提高植物的抗逆性提供依據(jù)，同時為運用基因工程技術培育花卉品種提供依據(jù).
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(責任編輯：田 軍)
Overexpression of Lycium chinense Miller Phytoene Sythase (LmPSY)Gene to Enhance the Resistance of Eustoma grandiflorum
Ji Jing1,2，Cao Haiyan1，Wang Gang2，Liu Jie1，Li Zhaodi1，Wu Weidang2
(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Research Institute of Genetic Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)
Carotenoids play an important role in plant tolerance to salt and high light，and phytoene synthase(PSY)is a key enzyme in carotenoids biosynthesis. Lycium chinense Miller phytoene sythase(LmPSY) gene was transferred to Eustoma grandiflorum to enhance the resistance of transgenic Eustoma grandiflorum. RT-qPCR results show that LmPSY expression had tissue specificity. High performance liquid chromatography results exhibit that the total carotenoid content of the transgenic plants was enhanced(1.3 fold) and zeaxanthin and lutein were produced in larger quantities (up to 1.1 fold). Under high light stress，fresh mass and dry mass of transgenic eustoma increased significantly compared with those of wide type(WT). Under 200 mmol/L NaCl stress, the amount of peoxidase(POD) and superoxide dismutase(SOD)in transgenic plants has increased significantly compared with those in WT. The photochemical efficiency(Fv/Fm)of transgenic plants increased by 8.0%—9.3%. These physiological and biochemical indices measured under light and salt stress conditions prove that overexpression of LmPSY gene could enhance the salt and high light tolerance of transgenic eustoma.
Eustoma grandiflorum；LmPSY；high light tolerance；salt tolerance
Q819
A
0493-2137(2015)03-0262-07
10.11784/tdxbz201312019
2013-12-06；
2014-01-20.
國家轉基因生物新品種培育重大專項資助項目(2014ZX08003-002B)；國家自然科學基金資助項目(31271793，31271419).
季 靜（1965— ），女，博士，教授，jijingtjdx@163.com.
王 罡，wanggangtjdx@126.com.
時間：2014-03-20.
http：//www.cnki.net/kcms/doi/10.11784/tdxbz201312019.html.
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季 靜，曹海燕，王 罡，柳 潔，李招娣，武衛(wèi)黨
(1. 天津大學化工學院，天津 300072；2. 天津大學遺傳工程研究所，天津 300072)
過表達枸杞LmPSY基因提高洋桔?？鼓嫘缘难芯?/p>
季 靜1,2，曹海燕1，王 罡2，柳 潔1，李招娣1，武衛(wèi)黨2
(1. 天津大學化工學院，天津 300072；2. 天津大學遺傳工程研究所，天津 300072)
類胡蘿卜素與植物的光保護及耐鹽有很大關系，八氫番茄紅素合成酶(PSY)是類胡羅素合成重要酶．將來自枸杞(Lycium chinense Miller)的八氫番茄紅素合成酶(LmPSY)基因在洋桔梗中過表達，旨在提高其抗逆性．RT-qPCR結果發(fā)現(xiàn)LmPSY基因在轉基因洋桔梗中有組織差異表達．高效液相色譜結果說明轉基因洋桔梗葉片總類胡蘿卜素提高 1.3倍，玉米黃質(zhì)和葉黃素含量提高 1.1倍．強光脅迫條件下，轉基因洋桔梗鮮重和干重較非轉基因植株有顯著提高．200,mmol/L氯化鈉脅迫條件下，轉基因洋桔梗過氧化物酶(POD)和超氧化物酶(SOD)含量有顯著提高，轉基因植株的熒光參數(shù)(Fv/Fm)提高 8.0%～9.3%．強光和鹽脅迫條件下對轉基因植株生理生化指標的測定證明洋桔梗的耐強光性及耐鹽性有顯著提高．
洋桔梗；八氫番茄紅素合成酶基因；耐強光性；耐鹽性
洋桔梗(Eustoma grandiflorum)別名草原龍膽，有綠色、白色、紫色、紅色、粉色等花色．原產(chǎn)于北美洲，后引種至日本和歐洲，經(jīng)過雜交改良后成為異常新奇、妖媚動人的花卉[1-2]．自 1982年推出單瓣的海地系列和重瓣的回音系列以來，洋桔梗的銷售量急劇增加．目前，年銷售量達到 1×108支，年銷售額1.1×108美元，列切花排名第7位[3]．洋桔梗適宜在溫暖、濕潤和陽光充足的地區(qū)種植，是一種較耐寒、不耐鹽和強光照射的植物．而天津市為重鹽堿城市，土壤鹽漬化嚴重，鹽堿地綠化難度大，而且夏季強光照射較嚴重，因此無法大面積種植洋桔梗．于是研究人員開始培育新的洋桔梗品種增強其抗逆性，目前普遍認為植物基因工程的手段速度快并且見效快[4]，已經(jīng)利用植物基因工程手段培育了大豆、玉米、番茄、小麥等許多植物的抗逆性較強的新品種[5-7]．關于洋桔梗基因工程的研究大都是關于花色及花香的研究，2004年我國學者毛元榮等[8]將類黃酮途徑相關基因NPRI通過農(nóng)桿花色菌介導法導入洋桔梗中，研究其花色的改變，2007年Aranovich等[9]將來自仙女扇的BEAT基因?qū)胙蠼酃＃瑢ζ浠ㄏ阕兓M行了研究.關于通過基因工程手段增強洋桔?？鼓嫘缘难芯坎⒉皇呛芏?，2012年本研究室 Wu等[10]通過農(nóng)桿菌介導法將與類胡蘿卜素相關基因AtchyB導入洋桔梗發(fā)現(xiàn)洋桔梗耐強光性有顯著提高．
在類胡蘿卜素生物合成途徑上游，兩分子的牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(GGPP)在八氫番茄紅素合成酶(PSY)的作用下形成一種復雜的類胡蘿卜素——八氫番茄紅素，經(jīng)過后續(xù)幾步反應可以形成 ABA (abscisic acid)[11]. 關于類胡蘿卜素生物合成的研究已經(jīng)比較清楚．由于類胡蘿卜素鑲嵌于葉綠體和有色體膜中，它們消除活性氧，淬滅活性的三重態(tài)分子、單線態(tài)氧，抑制有害自由基的形成，防止植物的光滅活和光破壞，并參與消耗過剩光能的反應，與光保護的作用相關[12]．而脫落酸是植物體內(nèi)的脅迫相關激素，在介導植物抗逆信號應答過程中起著重要作用，在鹽堿及干旱條件下，植物內(nèi)源ABA水平會提高．自2008年Li等[13]發(fā)現(xiàn)玉米中的PSY3基因轉錄水平與非生物脅迫相關，表明 PSY基因與非生物脅迫抗性相關后，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)將鹽角草 PSY基因在擬南芥中過表達，可以提高擬南芥的抗非生物脅迫能力[14]，將葡萄柚果實中的 PSY基因在煙草中過表達可以提高煙草的抗非生物脅迫能力[15]．
筆者運用農(nóng)桿菌轉化法，將從枸杞中分離的八氫番茄紅素合成酶基因(LmPSY)轉入 Green品種洋桔梗中，進行強光和鹽脅迫處理，并且對其生理生化指標進行了測定[16-17]．旨在培育出具有耐強光、耐鹽堿的洋桔梗品種，適宜在天津這樣土地鹽堿化較嚴重并且有強光直射的地區(qū)種植，從而擴大洋桔梗的種植范圍，培育出更多洋桔梗以滿足市場需求．
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 植物材料
Green品種的洋桔梗．
1.1.2 質(zhì)粒載體和農(nóng)桿菌菌株
本實驗所用質(zhì)粒載體為本實驗室(天津大學遺傳工程研究所)保存的植物雙元表達質(zhì)粒載體pCAMBIA2300，含有卡那霉素抗性基因質(zhì)粒圖譜見圖 1．本實驗所用根癌農(nóng)桿菌株為本實驗室保存的含有pCAMBIA2300-LmPSY質(zhì)粒的C58菌株．
圖1 pCAMBIA2300-LmPSY載體圖譜Fig.1 Schematic representation of plasmid pCAMBIA2300-LmPSY
1.1.3 培養(yǎng)基
培養(yǎng)基成分及種類見表1.
表1 培養(yǎng)基Tab.1 Medium formulation
1.2 洋桔梗遺傳轉化
1.2.1 外植體
將洋桔梗種子滅菌后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，待其長出4～5片葉子時，取葉片將其切成0.5,cm2大小的葉盤備用．
1.2.2 農(nóng)桿菌浸染液的制備
挑取Kana(質(zhì)量濃度為100,mg/L)的YEP固體培養(yǎng)基上生長的單菌落至Kana濃度相同的50,mL YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至 OD600值為 0.6～0.8，3,800,r/min離心3,min收集菌體，用相同體積農(nóng)桿菌重懸液重懸菌體，作為浸染液[10,18]．
1.2.3 洋桔梗葉盤的浸染轉化
將上一步中制得的農(nóng)桿菌浸染液轉移至盛有洋桔梗葉盤的無菌三角瓶中，浸泡 15,min，將洋桔梗葉盤接種至共培培養(yǎng)基，于22,℃暗培養(yǎng)3,d．
將共培后的洋桔梗葉盤從共培培養(yǎng)基上轉移至篩選培養(yǎng)基，每2周繼代1次，頭孢霉素的質(zhì)量濃度由400,mg/L逐漸降低至100,mg/L，葉盤邊緣長出愈傷組織后，將愈傷組織塊切下，接種至新的篩選培養(yǎng)基．
1.2.4 不定芽的生根與移栽
當抗性不定芽高度超出 3,cm后，將其切下，放入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)．待不定芽的根伸長至 4,cm左右時將其移栽至含有蛭石、珍珠巖和營養(yǎng)土的花盆中．待洋桔梗結種子后，收取種子在 Kana(質(zhì)量濃度為50,mg/L)的1/2,MS培養(yǎng)基中萌發(fā)，待植株到四葉期時移栽至花盆中進行后續(xù)研究．
1.3 轉基因洋桔梗分子檢測與表達分析
1.3.1 轉基因洋桔梗分子的檢測
(1) 抗性植株的PCR檢測. 采用CTAB法提取對照和抗性植株基因組DNA，根據(jù)LmPSY基因設計引物PSYF、PSYR，進行PCR檢測．
(2) 轉基因植株的RT-PCR檢測. 采用Trizol法提取對照和轉基因植株葉片總 RNA，用天根公司TransScript TransStartTM one-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄合成的cDNA第一鏈作為模板．用引物PSYF和PSYR檢測LmPSY基因的表達．根據(jù)洋桔梗泛素合成酶基因(EgUBi，作為內(nèi)參)設計引物 EgUbiF、EgUbiR進行 RT-PCR檢測．引物序列見表2．
表2 引物序列Tab.2 Primer sequences
1.3.2 實時定量PCR檢測轉基因洋桔梗組織差異表達
用軟件primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer 3/)設計熒光定量 PCR引物：PSYQPCRF、PSYQPCRR.仍然用泛素合成酶基因作內(nèi)參基因，其引物仍然用EgUbiR 和 EgUbiF．用 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN，德國)分別提取轉基因洋桔梗根、莖、新葉、老葉總RNA，合成cDNA第一鏈方法見RT-PCR檢測．用Top Green qPCR SuperMix(TRANS，中國)做實時定量 PCR檢測，反應體系為：PSYQPCRF (10,μmol/L)0.5,μL，PSYQPCRR (10 μmol/L)0.5 μL，2×TransStartTMTop Green qPCR SuperMix 12.5,μL， passive Reference Dye 0.5,μL，cDNA 1,μL．反應條件為 94,℃ 30,s，94,℃ 5,s，60,℃ 15,s，72,℃ 10,s，40個循環(huán)．
1.3.3 類胡蘿卜素含量檢測
(1) 總類胡蘿卜素的提取及檢測．稱取 0.2,g新鮮洋桔梗葉片轉移至離心管中，用組織研磨器進行研磨之后加入2,mL 60% KOH和20,mL甲醇劇烈振蕩混勻，60,℃水浴 20,min，用 15,mL含有 50%乙醚的石油醚作為萃取劑萃取總類胡蘿卜素．將提取的類胡蘿卜素溶于丙酮，用紫外分光光度計測定樣品在450,nm 處的吸光值，葉片中總類胡蘿卜素含量計算式為
式中：X為總類胡蘿卜素含量，μg/g；A為樣品在450,nm 處的吸光度；V為提取液的體積；ε 為類胡蘿卜素分子平均消光系數(shù)，2,100；m為稱取的洋桔梗葉片質(zhì)量，g．
(2) 洋桔梗葉片色素的高效液相色譜分析．將樣品溶于60,μL丙酮，取20,μL進樣進行高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography，HPLC).流動相為異丙醇、乙腈和甲醇，體積比為 5∶85∶10．使用Thermo二極管陣列檢測器全波長掃描類胡蘿卜素譜圖．
1.3.4 表型的變化
類胡蘿卜素是植物重要的色素物質(zhì)之一，由于植物不同組織中類胡蘿卜素各成分組成的不同，使植物莖、葉、花和果實等呈現(xiàn)不同的顏色．PSY基因是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶基因，PSY基因的過表達往往會引起一些下游代謝產(chǎn)物(如玉米黃質(zhì)和葉黃質(zhì)等)的積累量發(fā)生變化，從而導致植物的表型發(fā)生變化．
1.3.5 光脅迫洋桔梗
將長勢相同的L1品系、L4品系、非轉基因植株分為2組，每組中每個品系設置3個重復．其中一組為實驗組，另一組為對照組．對照組在正常光照條件(180,μmol/(m2·s))下培養(yǎng)，實驗組置于弱光照(75,μmol/(m2·s))條件下培養(yǎng)，1周后，測葉片的干重與鮮重比(mD/mF)．然后，將實驗組在正常光照條件下培養(yǎng) 1周后，在強光(1,000,μmol/(m2·s))脅迫下培養(yǎng)6周，測量mD和mF．mD和mF的測定方法參見文獻[10]．
1.3.6 200,mmol/L氯化鈉處理洋桔梗
采用200,mmol/L的氯化鈉對轉基因洋桔梗和非轉基因型洋桔梗施以脅迫 20,d后，測定其熒光參數(shù)(Fv/Fm)，并且取葉片，提取細胞可溶性蛋白，測定其超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性．用光合儀(LI-6400,XT)對熒光參數(shù)進行測定．SOD、POD、CAT的測定分別使用南京建成生物工程研究所的試劑盒：A001-1超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(測總 SOD)；A084-2過氧化物酶(POD)測定試劑盒；A007-1 過氧化氫酶(CAT)測試盒．
2 結果與分析
2.1 LmPSY基因在洋桔梗中的表達分析
(1) 提取抗性和非轉基因型洋桔?；蚪M DNA為模板，以引物PSYF和PSYR做PCR檢測，并以質(zhì)粒pCAMBIA2300-LmPSY為陽性對照，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR檢測結果如圖2所示．結果表明有 4個細胞系出現(xiàn)目的條帶(1,341,bp)．分別將其標記為品系L1、L2、L3和L4和進行后續(xù)研究．
圖2 洋桔梗葉片基因組PCR檢測結果Fig.2 Result of PCR assay of eustoma leaf genome
(2) 對PCR檢測呈陽性的4個細胞系和未轉化植株進行 RT-PCR檢測，4個細胞系 L1、L2、L3、L4都擴增出泛素合成酶基因并且擴增出與目的基因大小相同的片段，而非轉基因型植株未擴增出相應目的條帶，如圖3所示．
圖3 RT-PCR檢測LmPSY表達Fig.3 RT-PCR assay of LmPSY expression
2.2 實時定量PCR檢測轉基因植株不同組織表達
圖4 通過實時定量 PCR測定轉基因洋桔梗不同組織的LmPSY相對表達量Fig.4 Real-time quantitative PCR analysis of LmPSY relative expression in different eustoma tissues
2.3 轉基因植株的HPLC檢測
分別測定非轉基因型和轉基因洋桔梗葉片中的類胡蘿卜素含量．用吸光度法測得轉基因洋桔梗品系 L1和 L3葉片中總類胡蘿卜素含量分別為58.1,μg/g和 59.0,μg/g，非轉基因型洋桔梗葉片中總類胡蘿卜素含量為 46.5,μg/g，L1和 L3總類胡蘿卜素含量分別提高了 25.0%和 26.9%．β類胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素是綠色葉片中的主要類胡蘿卜素，LmPSY是類胡蘿卜素生物代謝途徑中的關鍵酶，它的過量表達使轉基因洋桔梗葉片中的玉米黃質(zhì)和葉黃素含量與非轉基因型洋桔梗相比都有顯著提高.如表3所示．
表3 轉基因洋桔梗葉片類胡蘿卜素含量Tab.3 Leaf carotenoid compositions of transgenic eustoma leaves
2.4 轉基因洋桔梗表型的變化
在洋桔梗中過表達 LmPSY基因后，其表型的改變?nèi)鐖D5所示．由圖可以看出轉基因洋桔梗葉片的葉型和顏色與非轉基因洋桔梗有所不同，轉基因洋桔梗的葉片較寬厚，并且葉片中鑲嵌的黃色部分較多[10]．
圖5 轉基因洋桔梗葉片的變化Fig.5 Changes in transgenic eustoma leaves
2.5 光脅迫條件下生理指標的測定
弱光(75,μmol/(m2·s))條件下，測葉片的干重與鮮重比(mD/mF)結果如圖 6所示，在低光照條件下轉基因植株的mD/mF明顯比野生型植株的高，在正常光照下(180,μmol/(m2·s))轉基因比非轉基因的mD/mF略有提高，但差異并不顯著．
將實驗組在強光(1,000,μmol/(m2·s))脅迫下培養(yǎng) 6周后，其生物量測量情況如圖 7所示，結果顯示，光脅迫對非轉基因植株生物量的影響比對轉基因型植株影響大，強光脅迫下非轉基因型植株mF和mD分別是正常光照下的54%和58%．而光脅迫下兩個品系L1和L4的轉基因植株的mF和mD分別為正常光照條件下的 89%、88%和 86%、85%．這也進一步驗證 LmPSY基因在提高植物抗強光和弱光脅迫中有作用.
圖6 弱光和正常光照條件下非轉基因植株和轉基因植株葉片的mD/mFFig.6 Ratio of dry mass to fresh mass(mD/mF)of wildtype (WT)and transformants L1 and L4 under low light and normal light conditions
圖7 強光和正常光照條件下非轉基因植株和轉基因植株的干重和鮮重Fig.7 Fresh mass(mF)and dry mass(mD)of wild-type (WT)and transformants L1 and L4 under high light and normal light condition
2.6 鹽脅迫后生理指標的測定
(1) 抗氧化物酶活性 SOD、POD的測定結果如圖8所示，在正常生長條件下，非轉基因型與轉基因的SOD、POD值沒有差異，SOD為56.9～64.2,U/mg，POD為 64.9～67.2,U/mg．鹽脅迫條件下，非轉基因型SOD提高到86.2,U/mg，L3提高到133.5,U/mg，非轉基因型 POD提高到 96.1,U/mg，L3提高到161.8,U/mg．而未檢測到CAT活性．
圖8 抗氧化物酶活性Fig.8 Antioxidant enzyme activity
(2) 由于逆境脅迫對光合作用各過程產(chǎn)生的影響可通過體內(nèi)葉綠素熒光誘導動力學變化反映．因此，葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm)可作為逆境條件下植物抗逆反應指標之一．Fv/Fm反映最大光化學量子產(chǎn)量，反映 PSⅡ反應中心光能轉換效率．在正常生長條件下，測得轉基因植物與非轉基因植物 Fv/Fm并無差異，皆為 0.83．為確定轉基因植物對鹽脅迫的適應能力，筆者測定L1、L2、L3 3個品系洋桔梗鹽脅迫后的Fv/Fm，結果如表4所示．在鹽脅迫條件下，對照和轉基因洋桔梗的Fv/Fm都有所降低．但在鹽脅迫條件下，3個品系轉基因洋桔梗的Fv/Fm分別為0.81、0.82及 0.81；而對照為 0.75，轉基因植株比非轉基因型植株的Fv/Fm提高了8.0%～9.3%．
表4 鹽脅迫條件下洋桔梗的Fv/Fm值Tab.4 Fv/Fmunder salt treatment
3 討 論
Giuliano等[19]報道番茄 PSY基因表達是相對恒定的，在葉子成熟過程中 PSY基因表達下調(diào)．Salvini等[15]研究向日葵發(fā)現(xiàn)HAPSY表達在葉子成熟過程中是受到調(diào)控的．而本研究發(fā)現(xiàn)轉基因洋桔梗老葉較新葉表達量高，與Salvini結論相符．
1999年 G?tz等[20]將來自細菌的八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(ChyB)轉化入藻青菌 Synechococcus PCC794中，使該菌株能夠積累高含量的 β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)，經(jīng)紫外線處理后，發(fā)現(xiàn)轉基因藻清菌 Synechococcus PCC7942的抗紫外輻射的能力有很大提高，同時發(fā)現(xiàn)內(nèi)生玉米黃質(zhì)較β-類胡蘿卜素抗紫外線更有效．2002年，G?tz等[21]為了研究類胡蘿卜素在植物光脅迫中的作用，將來自細菌的 CrtZ基因通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草中，使煙草中玉米黃質(zhì)積累量增加，從而提高煙草對紫外線輻射的抗性．2006年 Schafer等[22]研究發(fā)現(xiàn)在藻青菌 Synechococcus PCC7942中強光刺激下類胡蘿素生物合成上調(diào). 2014年本研究室 Zhao等[23]將來自擬南芥中的 chyB基因轉入煙草，發(fā)現(xiàn)煙草中葉黃素含量提高后改善了其 UV抗性．本研究中強光脅迫洋桔梗后，發(fā)現(xiàn)轉基因植株較非轉基因型植株受影響小，而非脅迫條件下 HPLC分析結果顯示轉基因洋桔梗中玉米黃質(zhì)和葉黃素含量更高．所以有可能是因為玉米黃質(zhì)和葉黃素的提高，葉黃素循環(huán)池被放大可以進一步提高植物的抗強光能力．由此可以推斷本研究中的洋桔梗的UV抗性也可能有所提高，筆者將會對其進行進一步研究．
在鹽脅迫過程中，開始用100,mmol/L、200,mmol/ L、300,mmol/L和 500,mmol/L NaCl脅迫洋桔梗發(fā)現(xiàn)，300,mmol/L NaCl以上濃度洋桔梗生長緩慢，不適宜測定生理數(shù)據(jù)，因此選擇200,mmol/L NaCl進行脅迫．Han等[13]于2008年在擬南芥中高表達鹽角草PSY基因，在 100,mmol/L NaCl脅迫下，發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥比非轉基因型擬南芥的 Fv/Fm提高 9.3%～ 16.6%．而本研究中發(fā)現(xiàn)在洋桔梗中過表達枸杞 PSY基因，在 200,mmol/L NaCl脅迫下，轉基因植株比非轉基因型植株的Fv/Fm提高8.0%～9.3%. Salvini等[15]證明 PSY對于植物在脅迫條件下合成 ABA非常重要，本研究中枸杞 LmPSY基因提高植物的耐鹽能力較顯著，可能是由于在鹽脅迫條件下，LmPSY基因過表達提高了植物中合成的ABA．
Salvini等[15]的研究表明將葡萄柚果實中的 PSY基因在煙草中過表達可以提高煙草的耐干旱能力，本研究未對轉基因植物進行干旱脅迫，在接下來的工作中會進一步研究轉LmPSY基因洋桔?？垢珊的芰κ欠裼兴岣撸?/p>
雖然洋桔梗有白色、綠色、紫色、粉色多種花色，但市場對于深黃色或橙色洋桔梗需求仍然很大．到目前為止，并沒有通過傳統(tǒng)育種或轉基因方法得到黃色洋桔梗．本研究中 LmPSY基因也可以引起花中類胡蘿卜素的積累，產(chǎn)生黃綠色花．本研究中共得到 4個細胞系，L1有10株，L2有8株，L3有7株，L4有10株．接下來將會進一步研究是否可以得到穩(wěn)定遺傳黃綠色抗逆洋桔梗，以滿足市場需求．
4 結 語
本研究將來自枸杞的LmPSY基因成功在洋桔梗中過表達．高效液相色譜結果發(fā)現(xiàn)轉基因洋桔梗葉片總類胡蘿卜素提高1.3倍，玉米黃質(zhì)和葉黃質(zhì)含量提高 1.1倍．強光脅迫條件下，轉基因洋桔梗鮮重和干重較非轉基因植株有顯著提高．200 mmol/L氯化鈉脅迫條件下，轉基因洋桔梗過氧化物酶(POD)和超氧化物酶(SOD)含量有顯著提高，轉基因植株的熒光參數(shù)(Fv/Fm)提高 8.0%～9.3%．強光和鹽脅迫條件下對轉基因植株生理生化指標的測定證明洋桔梗的耐強光性及耐鹽性有顯著提高．本研究為類胡蘿卜素生物合成途徑中相關酶基因可以用來提高植物的抗逆性提供依據(jù)，同時為運用基因工程技術培育花卉品種提供依據(jù).
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(責任編輯：田 軍)
Overexpression of Lycium chinense Miller Phytoene Sythase (LmPSY)Gene to Enhance the Resistance of Eustoma grandiflorum
Ji Jing1,2，Cao Haiyan1，Wang Gang2，Liu Jie1，Li Zhaodi1，Wu Weidang2
(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Research Institute of Genetic Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)
Carotenoids play an important role in plant tolerance to salt and high light，and phytoene synthase(PSY)is a key enzyme in carotenoids biosynthesis. Lycium chinense Miller phytoene sythase(LmPSY) gene was transferred to Eustoma grandiflorum to enhance the resistance of transgenic Eustoma grandiflorum. RT-qPCR results show that LmPSY expression had tissue specificity. High performance liquid chromatography results exhibit that the total carotenoid content of the transgenic plants was enhanced(1.3 fold) and zeaxanthin and lutein were produced in larger quantities (up to 1.1 fold). Under high light stress，fresh mass and dry mass of transgenic eustoma increased significantly compared with those of wide type(WT). Under 200 mmol/L NaCl stress, the amount of peoxidase(POD) and superoxide dismutase(SOD)in transgenic plants has increased significantly compared with those in WT. The photochemical efficiency(Fv/Fm)of transgenic plants increased by 8.0%—9.3%. These physiological and biochemical indices measured under light and salt stress conditions prove that overexpression of LmPSY gene could enhance the salt and high light tolerance of transgenic eustoma.
Eustoma grandiflorum；LmPSY；high light tolerance；salt tolerance
Q819
A
0493-2137(2015)03-0262-07
10.11784/tdxbz201312019
2013-12-06；
2014-01-20.
國家轉基因生物新品種培育重大專項資助項目(2014ZX08003-002B)；國家自然科學基金資助項目(31271793，31271419).
季 靜（1965— ），女，博士，教授，jijingtjdx@163.com.
王 罡，wanggangtjdx@126.com.
時間：2014-03-20.
http：//www.cnki.net/kcms/doi/10.11784/tdxbz201312019.html.
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