慢性神經根型頸椎病動物模型的建立

金哲峰，徐凡平，朱立國，于 杰，王 平，畢方杉

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102；4.北京市豐盛中醫(yī)骨傷?？漆t(yī)院，北京 100033）

慢性神經根型頸椎病動物模型的建立

金哲峰1，徐凡平2，朱立國3，于 杰3，王 平1，畢方杉4

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102；4.北京市豐盛中醫(yī)骨傷?？漆t(yī)院，北京 100033）

[目的]通過模擬慢性頸椎間盤退變及關節(jié)突關節(jié)雙重退變，建立慢性神經根型頸椎病的動物模型。[方法]將48只SD大鼠分層隨機分為兩組:模型組、假手術組。觀察大鼠行為學變化，并分別于術前1 d、術后29 d拍頸椎X線片側位片，觀察椎間盤退變的情況；術前1 h、術后29 d后分別測定右側臂叢神經的感覺神經傳導速度和運動神經傳導速度；記錄神經電生理變化。[結果]該模型可以出現明顯椎間盤變化及神經功能傳導損傷的變化。[結論]模擬慢性頸椎間盤退變及關節(jié)突關節(jié)雙重退變的動物模型可以對神經根型頸椎病（慢性期）加以反映。

神經根型頸椎?。宦云?；動物模型

神經根型頸椎?。–SR）是一種臨床常見的疾病，是由于頸椎間盤和周圍結構逐漸發(fā)生退行性變、骨質增生、或頸椎生理曲線改變后刺激或壓迫頸神經引起的一組綜合癥狀[1]。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 8月齡健康SPF級雌雄（SD）大鼠共48只，雌鼠體質量220～255 g，雄鼠體質量450～600 g，由成都達碩實驗動物中心提供，（合格證號：SCXK（川）2008－24），在成都中醫(yī)藥大學動物中心SPF級動物實驗室內飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 Ⅱ型膠原蛋白酶（285 U/mg），Worthington BiochemicalCorporation,Lakewood，NJ，USA，批號48M10791；青霉素鈉注射液，批號100408，80萬U/支,福建匯天生物藥業(yè)有限公司提供；復合脫鈣液；中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院骨研所藥理實驗室提供。

1.3 主要試劑 兔抗鼠MMP-3(一抗)，批號BA1531；兔抗鼠 TIMP-1(一抗），批號 BA0575；兔抗鼠 IL-17(一抗)，批號 BA2416；兔抗鼠 IL-1β（一抗），批號BA2782；以上均由武漢博士德公司提供；兔抗鼠IL-20（一抗），批號bs-1834R由北京博奧森生物技術有限公司提供；戊巴比妥鈉，批號F20100312由上海國藥集團化學試劑有限公司提供；甲醛溶液，批號100511由淮南市偉企豪業(yè)化工有限公司提供；SP9001生物素標記山羊抗兔IgG免疫組化染色試劑盒，天津灝洋生物提供；試劑A：封閉用正常山羊血清工作液；試劑B：生物素化二抗工作液；試劑C：辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）；試劑D：3%H2O2去離子水；PBS磷酸鹽緩沖液（0.01mol/LPBS，pH 7.4）。

1.4 主要儀器設備 BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)，成都泰盟科技科技有限公司；34號鈍圓針頭，World Precision Instruments；數字化X射線攝影系統(tǒng)GE Definium 6000型DR美國GE公司；微量注射泵TJ-1A/L0107-1A，保定蘭格恒流泵有限公司；眼鏡架式手術放大鏡4X-370mm，北京中西遠大科技有限公司；石蠟切片機：QPJ-1C生物光學及攝影顯微鏡：OLYMPUSDP71、BX51；高溫烘烤箱：D-63450型，德國Heraens；電熱恒溫鼓風干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9080；上海一恒科技有限公司；生物組織包埋機：BMJ-1，天津航空機電公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 將48只8月齡健康SPF級雌雄(SD)大鼠采用分層隨機法分為假手術組（對照組），24只，手術組（實驗組），24只，雌雄各半。5只大鼠同養(yǎng)于一個大鼠盒中，雌雄分養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度為20～26℃，為了保持大鼠的生物節(jié)律，實驗室每日早晨 8∶00 至 20∶00 開燈，20∶00 至次日 8∶00 熄燈，實驗前5 d每日將大鼠置于實驗觀察箱中30min，使之適應環(huán)境的改變。

2.2 大鼠神經根型頸椎病模型的建立 在無菌手術室，大鼠腹腔麻醉（戊巴比妥鈉35mg/kg），麻醉生效后，俯臥位固定于大鼠板上，電動剃毛器剃毛，備皮范圍5 cm×4 cm。常規(guī)絡合碘消毒術區(qū)，鋪無菌手術巾，取頸部正中切口約4 cm，依次切開皮膚、皮下組織、脊柱旁肌肉，顯露兩側的關節(jié)突關節(jié)，造模組將配制好的膠原蛋白酶（10U/μL）緩慢注入C5/6，C6/7關節(jié)突關節(jié)（每個關節(jié)注入5μL，用34號鈍圓針頭），用輸液泵以4μL/min的速度注入。然后再切斷頸背部深肌群頸夾肌和頭、頸、寰最長肌，完全切除頸骼肋肌與頭半棘肌，然后再依次切斷C2～C7棘上和棘間韌帶，生理鹽水沖洗，止血，縫合筋膜及皮膚。

2.3 假手術對照組 在無菌手術室，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（35mg/kg）麻醉成功后，術區(qū)剃毛、大鼠板固定、常規(guī)碘伏消毒，取頸部正中切口約4 cm，依次切開皮膚、皮下組織，直達棘突，沖洗，止血，逐層縫合。術后常規(guī)青霉素抗菌治療3 d。

3 觀察指標

3.1 行為學觀察 動物有無煩躁、食欲降低、用嘴反復添前爪、倦怠、易激惹、活動頻繁等。

3.2 頸椎X線拍片 頸椎X線攝側位片，觀察椎間盤退變的情況（生理弧度改變，椎間隙變窄，椎體前后緣骨質增生）。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（35mg/kg）麻醉成功后，分別于術前1 d、術后29 d拍頸椎X線側位片。麻醉生效后，將大鼠置于自制的側位固定鼠板上，保證大鼠體位在前后拍片過程中位置固定不變。前后兩次拍片拍攝條件一樣。

4 電生理的測定

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（35mg/kg）麻醉成功后，術前1 h、術后29 d后分別測定右側臂叢神經的感覺神經傳導速度和運動神經傳導速度,每次測試重復2遍。

4.1 感覺神經傳導速度（SCV）測定 刺激電極置于大鼠右側腕部正中神經走行處，以針狀電極刺于皮下進行刺激，2個刺激點（A點、B點）距離為1 cm，針狀記錄電極置于鎖骨上窩Erb’s點，參考電極置于記錄電極（C點）右側2 cm處，右下肢接地。刺激參數為方波脈沖電流，波寬0.1ms，頻率1.9Hz，強度3mA，刺激延時100ms。信號記錄系統(tǒng)的前置放大器靈敏度20ms/div，濾波帶10～10 kHz，記錄時間200ms。潛伏期由計算機自動測量（T1、T2），兩個刺激點之間的距離輸入計算機，根據公式算出SCV（m/s）。

4.2 運動神經傳導速度（MCV）測定 經皮電刺激，第一點刺激（A點）（陽極）在C6棘突處，第二點刺激（B點）（陰極）在鎖骨上窩Erb’s點，右下肢接地，記錄電極鬁放置于橈側腕屈肌，記錄復合肌肉動作電位（CMAP）。刺激參數為方波脈沖電流，波寬0.1ms，頻率1.9Hz，強度3mA，刺激延時100ms。信號記錄系統(tǒng)的前置放大器靈敏度20ms/div，濾波帶10Hz～10 kHz，記錄時間200ms。潛伏期由計算機自動測量（T1、T2），兩個刺激點之間的距離輸入計算機，根據公式算出 MCV（m/s）。

5 統(tǒng)計方法

所得數據用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

6 結果

6.1大鼠行為學變化 術后1 d各組大鼠都恢復了正常的運動功能，體質量增加正常，未出現煩躁、用嘴反復添前爪、食欲降低等情況。術后2個月，模型組大鼠表現為倦怠、易激惹、活動頻繁、煩躁（撕咬肢體等）、用嘴反復添前爪等行為。對照組大鼠無異常行為，見表1。大鼠煩躁行為表現在撕抓頸部皮膚，模型組中有6只大鼠曾25次撕抓頸部皮膚，皮膚出現破損出血，對照中沒有出現此類情況。

6.2 影像學表現 對照組頸椎術后2個月變化不大，未出現頸椎生理曲度異常、椎間隙變窄、椎體前緣骨贅形成。見圖1-2。

模型組椎間隙變窄、椎體前緣骨贅形成、椎間孔變小及椎體排列異常等椎間盤退變的表現。見圖3-6。

6.3 造模前后大鼠正中神經傳導速度

6.3.1 感覺神經傳導速度（SCV） 模型組與對照組術前正中神經SCV比較，t=0.91，P=0.395，差異沒有統(tǒng)計學意義，術后比較，t=28.15，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學。模型組術前與術后SCV比較，t=22.55，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學意義，對照組術前與術后SCV比較，t=1.63，P=0.146，差異沒有統(tǒng)計學意義，見表2。

6.3.2 運動神經傳導速度（MCV） 模型組與對照組術前正中神經MCV比較，t=2.14，P=0.422，差異沒有統(tǒng)計學意義，術后比較，t=11.08，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學意義。模型組術前與術后MCV比較，t=17.91，P＜0.001，差異有統(tǒng)計學，對照組術前與術后MCV比較，t=1.61，P=0.151，差異沒有統(tǒng)計學意，見表3。

圖1對照組大鼠造模前頸椎關節(jié)間隙清晰Fig.1 The cervicalvertebra jointspace of ratswas clear in in the controlgroup before building

圖2 對照組大鼠造模后頸椎生理曲度變化不大，C5/6、C6/7椎間隙沒有明顯變化Fig.2 The cervicalphysiologicalcurvature changed little,and C5/6,C6/7 intervertebraldisc had no apparent change of rats in the controlgroup after building

圖3模型組大鼠造模前頸椎生理曲度正常Fig.3 The cervicalphysiologicalcurvature of ratswas normal in themodelgroup beforebuilding

圖4 模型組大鼠造模后頸椎生理曲度反弓Fig.4 The cervicalphysiologicalcurvature of ratswasarch in themodelgroup after building

圖5 模型組大鼠造模前頸椎關節(jié)間隙清晰Fig.5 The cervicalvertebra joint clearance of ratswas clear in themodelgroup before building

圖6 模型組大鼠造模后頸椎關節(jié)間隙模糊，變窄Fig.6 The cervicalvertebra joint clearance became fuzzy and narrow ing of rats in themodelgroup after building

表2 兩組大鼠正中神經SCV變化±s）Tab.2 Themedian nerve SCV changesof rats in two groups（±s）m/s

表2 兩組大鼠正中神經SCV變化±s）Tab.2 Themedian nerve SCV changesof rats in two groups（±s）m/s

組別 例數 感覺神經傳導速度 t P治術前 治術后模型組 8 16.39±0.25 13.53±0.22 22.55 0.000對照組 8 16.44±0.11 16.40±0.16 01.63 0.146

表3 兩組大鼠正中神經MCV變化（±s）Tab.3 Themedian nerveMCV changesof rats in two groups（±s）m/s

表3 兩組大鼠正中神經MCV變化（±s）Tab.3 Themedian nerveMCV changesof rats in two groups（±s）m/s

組別 例數 運動神經傳導速度 t P治術前 治術后模型組 8 15.32±0.19 12.86±0.50 17.91 0.000對照組 8 15.49±0.20 15.37±0.17 01.61 0.151

7 討論

7.1 神經根型頸椎病的造模方法的優(yōu)缺點 神經根型頸椎病的造模方法很多，梅榮軍等[2]選用Wistar大鼠,頸前鎖骨下入路，暴露臂叢神經根，用眼科顯微止血鉗整體鉗夾臂叢神經根1次，扣緊1扣，持續(xù)約30 s后消毒，縫合。造模方式，觀察術后21 d，造模側上肢已恢復部分功能。Rothman等[3]直接將分離出來的C7神經根用10gf橫斷面方向鉗夾15min，術后即刻出現異常疼痛。趙定麟等[4]通過增加椎間隙內壓的辦法來造成頸椎病模型。1個月后鏡下開始出現病理改變，3個月后出現明顯病理改變。張軍等[5]用浸有福爾馬林的定量濾紙片放在Wistar大白鼠頸6、7神經根下，模擬頸神經根炎實驗方法造成了大白鼠頸神經根炎癥反應。造模后7 d，模型組大鼠致炎物周圍的神經根出現嚴重的炎癥細胞浸潤，伴有神經纖維水腫、變性。謝煒等[6]用大鼠改良椎管插線方法建立神經根型頸椎病大鼠神經根性疼痛模型。楊大志等[7]建立了一種由自身骨性增生造成神經根慢性嵌壓損傷的動物模型。手術顯露家貓右側C7、C8和L5、L 6神經根及其椎間孔內口，用牙髓鉆破壞椎間孔周圍骨皮質后，將“V”形松質骨塊沿骨壁嵌于神經根通道的骨性管道內及側隱窩后方。此方法操作復雜，移植的骨塊容易松動，而且在神經根周圍操作容易造成神經手術損傷，不太適用小型動物，從而增加實驗經費。

綜上所述，神經根型頸椎病造模目前主要有兩種方法：一種直接造成神經擠壓型損傷；另一種在神經根旁放置刺激物直接的化學刺激引起神經根的炎性變。直接鉗夾或壓迫神經根引起神經根的急性炎癥反應，造成神經的敏感、變性，是根據神經根機械壓迫學說設計的一種造模方法。而神經根旁放置化學刺激物引起神經根的炎性變，是根據神經根化學刺激學說設計的一種造模方法，但是這兩種方法都不是很符合神經根型頸椎病的發(fā)病特點，神經根型頸椎病是機械性壓迫與炎性刺激協(xié)同作用造成神經根的損傷，而且退變椎間盤組織分泌炎性因子，引起免疫反應，加重疼痛癥狀。

7.2 建立新的神經根型頸椎病的理論基礎 目前公認椎間盤退變及關節(jié)突關節(jié)退變是導致脊柱的退變的主要原因[8]。有的學者認為關節(jié)突關節(jié)的變化繼發(fā)于椎間盤的退變[9-10]，在關節(jié)突關節(jié)和椎間盤退變的先后關系上現在仍存在爭議。一些研究者認為關節(jié)突關節(jié)的破壞和椎間盤退變沒有相關性[11]。而Swanepoel等[12]認為關節(jié)突關節(jié)的破壞和椎間盤退變之間有相關性。針對頸椎間盤的退變與關節(jié)突關節(jié)退變的相關研究較少。

關節(jié)突關節(jié)退變的方法采用Ⅱ型膠原蛋白酶關節(jié)突關節(jié)注射。Ⅱ型膠原蛋白酶介導的骨關節(jié)炎模型變化明顯，鄧宇等[13]比較不同蛋白酶誘導骨關節(jié)炎，低劑量的膠原蛋白酶可較稍高劑量的木瓜蛋白酶誘導出更為嚴重的軟骨退變。鏡下顯示軟骨細胞減少，排列紊亂，裂隙形成。膠原蛋白酶可直接對軟骨基質中的膠原纖維進行消化、分解，是構成關節(jié)軟骨的網狀支架遭到破壞，加速了骨關節(jié)炎的病程[14]。目前沒有Ⅱ型膠原蛋白酶介導的頸椎關節(jié)突關節(jié)炎的研究，筆者假設Ⅱ型膠原蛋白酶注射入頸椎關節(jié)突關節(jié)出現類骨關節(jié)炎變化，包括軟骨的降解，滑液的炎癥，軟骨下骨的改變，及骨贅的生成。本實驗采用顯微注射法，將34號注射針頭插入關節(jié)間隙，用輸液泵來控制藥物注入關節(jié)的藥量和速度，這樣既可以做到藥量的精準，還能保證藥液盡量的充滿整個關節(jié)間隙。

椎間盤退變模型采用的是動靜力失衡模型[15]，切斷大鼠的頸背部深群頸夾肌和頭、頸、寰最長肌，完全切除頸骼肋肌與頭半棘肌，然后再依次切斷C2～C7棘上和棘間韌帶。王擁軍等[16]用此法造模，5個月后模型成功。動物肌肉分群設計與人體頸部解剖特點相近，頸背部伸肌群破壞后肌力減弱、屈肌群力相應增強，動物始終呈屈頸狀態(tài)這與已證實的頸椎病最明顯的好發(fā)因素長期低頭工作相似[15]。

兩種方法聯合運用，Ⅱ型膠原蛋白酶關節(jié)突關節(jié)注射，造成關節(jié)退變，邊緣骨贅的生成，椎間盤的退變出現椎間隙的變窄，導致椎間孔的變小，神經根受到卡壓。術后2個月病理切片鏡下觀察：模型組大部分椎間盤的脊索性髓核皺縮，髓核組織中大多數為軟骨樣細胞，脊索細胞數量較少且大部分出現變性，軟骨終板變薄、前部纖維環(huán)層狀結構消失，個別椎間隙可見脊索性髓核消失及纖維環(huán)的裂隙。模型組大鼠神經根中可見大量炎性細胞浸潤，神經纖維變粗，大小不一，神經軸突及膜細胞結構不清，腫脹或消失，雪旺細胞自溶、軟化、核堆積。造模前后比較椎間隙變窄。甚至骨贅生成。X線表現模型組頸椎生理曲度變直甚至反弓、椎間隙變窄、椎體前緣骨贅形成、椎間孔變小及椎體排列異常等椎間盤退變的表現。模型組大鼠正中神經傳導速度與對照組比較明顯變慢。

從上述結果可以得出：頸椎后柱的不穩(wěn)定，尤其是關節(jié)突關節(jié)的退變對頸椎病的發(fā)生發(fā)展起到關鍵的作用，加速了椎間盤退變的進程。此模型藥物介導配合動靜力失衡，成功的復制了神經根型頸椎病，造模時間短，2個月，手術操作不直接刺激神經根，安全，動物成活率高，經濟。注射藥物定量，規(guī)范，適合推廣。

本研究建立的神經根型頸椎病的模型是將椎間盤退變因素與關節(jié)突關節(jié)退變因素復加，與其他模型比較更符合神經根型頸椎病的發(fā)病機制。

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Establishmentof chronic animalmodelof the nerve root cervicalspondylosis

JINZhe-feng1，XU Fan-ping2，ZHU Li-guo3,YU Jie3，WANGPing1，BIFang-shan4
（1.The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193,China；2.Beijing Hospitalof TraditionalChineseMedicine，Beijing100010,China；3.Wangjing Hospital，Chinese Academy ofChineseMedical Sciences,Beijing 100102,China；4.Beijing Fengsheng SpecialHospitalof TraditionalMedical Traumatology and Orthopaedics，Beijing100033,China）

[Objective]Toestablish chronic stagemodelof thenerve rootcervicalspondylosis in the rat through simulation of chronic cervical intervertebral disc and zygapophyseal joints degeneration.[Methods]The48 SD ratswere randomly divided into two groups,model group and false operation group,and observation of intervertebral disc degeneration by cervical spine lateral X-ray respectively 1 d of preoperative and 29 d of postoperative,and detecting the rightbrachial plexusnerve sensory nerve andmotor nerve conduction velocity,recording electrophysiological changes.[Results]Themodel could obviously change of intervertebral disc and nerve conduction function damage changes.[Conclusion]Themethod of simulation of chronic cervical intervertebral disc and zygapophyseal joints degeneration could reflecta chronic stagemodelof thenerve rootcervicalspondylosis.

nerve rootcervicalspondylosis;chronic stage;animalmodel

R681.55

A

1672-1519（2015）09-0558-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.09.13

金哲峰（1979-），男，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)骨傷研究工作。

2015-04-20）

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