TNF－α 對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞睪酮分泌及細(xì)胞增殖的影響

吳海明 (廣東省惠州市第二婦幼保健院，廣東 惠州 516001)

多囊卵巢綜合癥(PCOS)是一種發(fā)病機(jī)理尚不清楚的復(fù)雜性全身性內(nèi)分泌神經(jīng)代謝機(jī)制失控癥候群，以性腺軸失調(diào)為主要癥狀，一般認(rèn)為引起該病癥發(fā)生的原因包括遺傳因素、胰島素抵抗、下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌功能異常、腎上腺功能出現(xiàn)亢進(jìn)等因素，但因上述任一學(xué)說(shuō)均無(wú)法對(duì)PCOS 病理變化及臨床表現(xiàn)進(jìn)行全面解釋，該病癥仍是婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)［1－2］。部分研究認(rèn)為，PCOS 的發(fā)病原因可能類似動(dòng)脈粥樣硬化以及糖尿病等炎性反應(yīng)性疾病，其發(fā)病原因與白細(xì)胞介素－6(IL－6)、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)以及C－反應(yīng)蛋白(CRP)等炎性反應(yīng)因子的高水平表達(dá)有關(guān)［3－4］，為探討PCOS 發(fā)病機(jī)制與炎性反應(yīng)因子TNF－α 之間的關(guān)系，在此以豬卵泡內(nèi)膜細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑:本研究所用主要儀器包括γ 放射免疫計(jì)數(shù)器、流式細(xì)胞儀、倒置熒光顯微鏡以及二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱等，型號(hào)分別為安徽合肥中國(guó)科技大學(xué)中佳公司Gc－91、BDFACSCaibur、Nikon Eclipse TE2000－U 以及HEPA CLASS 100。所用試劑及試劑盒主要包括睪酮放射免疫測(cè)定試劑盒，由北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn);36%乙酸溶液，來(lái)自上?；瘜W(xué)試劑公司;胎牛血清(FBS，杭州四季青);CFDA SE 細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒，來(lái)自碧云天生物技術(shù)研究所;還包括胰蛋白酶(Sigma)，透明質(zhì)酸酶(Sigma)，膠原酶Ⅱ(TBD)，DMEM/F12［1∶1培養(yǎng)液(Hyclone)］以及豬重組TNF－α(prospec)。

1.2 方法:取新鮮豬卵巢放置于內(nèi)含雙抗的冰生理鹽水中保存2 h，之后進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)前采用生理鹽水對(duì)卵巢進(jìn)行反復(fù)沖洗，于平皿中選取直徑5 mm 左右的健康卵泡，并采用顯微解剖剪于解剖顯微鏡下將其對(duì)半剪開以流出卵泡液。之后掛出卵泡表面顆粒細(xì)胞，并使用顯微鑷剝離呈現(xiàn)帽狀的卵泡內(nèi)膜。剝離后反復(fù)采用生理鹽水沖洗，之后剪碎加入內(nèi)含胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶以及膠原酶Ⅱ的酶液中，并置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃恒溫消化半小時(shí)，消化期間可采用移液管反復(fù)吹打以加速消化進(jìn)程。消化后100 目濾網(wǎng)濾過(guò)，經(jīng)過(guò)5 min 200 g離心去酶和生理鹽水水洗后，將獲得的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞懸浮于含1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基中臺(tái)盼藍(lán)染色備用［5］。采用CFDA 檢測(cè)試劑盒對(duì)上述備用之豬卵泡內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行CFDA 標(biāo)記，DMEM/F12 稀釋，形成細(xì)胞懸液。將所得懸浮液加入24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，于培養(yǎng)板中加入TNF－α，獲 得 濃 度 分 別 為0 pg/ml、10 pg/ml、100 pg/ml 以 及1 000 pg/ml的四個(gè)組別濃度，其中不含TNF－α 的組別視為對(duì)照組，其余三組為試驗(yàn)組，每種濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣。放置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃恒溫培養(yǎng)48 h 后換液，換液后72 h 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞增殖情況［6］。此外，加入TNF－α 后24 h、48 h 及72 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采用RIA，即放射免疫分析法測(cè)定對(duì)照組及試驗(yàn)組中細(xì)胞上清液睪酮濃度，并進(jìn)行對(duì)比和統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:該次研究結(jié)果數(shù)據(jù)均采用Excel 數(shù)據(jù)庫(kù)整理且所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)全部在SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件上予以處理，組間差異均采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

于培養(yǎng)液中加入TNF－α 后，設(shè)置濃度分別為10 pg/ml、100 pg/ml 以及1 000 pg/ml 三個(gè)組別的試驗(yàn)組，以及一個(gè)未加入TNF－α 的對(duì)照組分別于24 h、48 h 以及72h 對(duì)豬卵泡內(nèi)膜細(xì)胞睪酮水平進(jìn)行放射免疫分析測(cè)定，睪酮水平未見顯著變化，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具體如表1 所示。培養(yǎng)72 h 后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)液總卵泡內(nèi)膜細(xì)胞濃度進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)置不添加TNF－α 的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，試驗(yàn)組中為卵泡內(nèi)膜細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)低于對(duì)照組，除了TNF－α 濃度為10 pg/ml 的組別，其他組別與對(duì)照組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，具體如下表2 所示?？梢奣NF－α 對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用，但對(duì)于細(xì)胞睪酮水平無(wú)明顯影響。

表1 TNF－α 刺激下卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌之睪酮變化

表1 TNF－α 刺激下卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌之睪酮變化

組別24 h 48 h 72 h對(duì)照組0.371±0.034 0.480±0.084 0.871±0.134試驗(yàn)組10 pg/ml 0.381±0.054 0.502±0.073 0.791±0.094 100 pg/m 0.401±0.061 0.471±0.055 0.790±0.104 1 000 pg/ml 0.361±0.023 0.491±0.054 0.719±0.123 t 值 0.013 0.028 0.019 P 值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表2 TNF－α 對(duì)豬卵泡內(nèi)膜細(xì)胞增殖情況影響

表2 TNF－α 對(duì)豬卵泡內(nèi)膜細(xì)胞增殖情況影響

組別 TNF－α 下72 h 后MFI對(duì)照組66.43±11.24試驗(yàn)組10 pg/ml 61.22±13.45 100 pg/m 53.12±11.43 1 000 pg/ml 47.28±10.49 t 值 1.93 P 值 ＜0.05

3 討論

TNF－α 最初由Shalaby 于巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)中得到并命名，其來(lái)源包括各種表皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等，經(jīng)過(guò)活化的單核巨噬細(xì)胞是其最主要的產(chǎn)生來(lái)源。TNF－α 具有多種較強(qiáng)的生物學(xué)活性，可有效提高機(jī)體內(nèi)中性粒細(xì)胞的吞噬殺傷能力，加強(qiáng)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的抗感染功能有著重要作用，還可有效抑制病毒復(fù)制，抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，并對(duì)機(jī)體內(nèi)脂肪代謝和糖代謝的調(diào)節(jié)有著重要意義［7－8］。

研究顯示，TNF－α 在PCOS 患者中水平明顯升高，與該病癥的發(fā)生有著緊密聯(lián)系，因而對(duì)TNF－α 代謝機(jī)理的研究對(duì)于PCOS 疾病發(fā)生機(jī)制研究有著重要價(jià)值。本文研究發(fā)現(xiàn)，將體外培養(yǎng)的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TNF－α 后，對(duì)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的睪酮分泌無(wú)明顯作用，但顯著增強(qiáng)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力，該作用可能與PCOS 患者發(fā)生的卵泡內(nèi)膜增生性病變和卵巢白膜增厚情況有著密切聯(lián)系［9］。部分研究表明，TNF－α 對(duì)細(xì)胞增殖的激活機(jī)制可能與C－Jun 氨基末端激酶等信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，此外TNF－α 還可以通過(guò)引發(fā)胰島素抵抗而間接影響PCOS 的進(jìn)展［10］。

［1］ 楊 華，曾娟花.血清TNF 與2 型糖尿病腎病及其中醫(yī)證型關(guān)系的臨床研究［J］.西部中醫(yī)藥，2014，27(1):11.

［2］ 倪 暾，農(nóng)媛冰.經(jīng)陰道超聲對(duì)多囊卵巢綜合征和多卵泡綜合征的鑒別診斷價(jià)值［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2011，32(31):6534.

［3］ 安 婧，田秀珠，土增榮，等.二甲雙胍對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢腫瘤壞死因子－α 表達(dá)及血清激素的影響［J］.中國(guó)藥物與臨床，2010，10(9):1000.

［4］ 劉艷巧，黨慧敏，劉潤(rùn)俠，等.助孕膠囊對(duì)多囊卵巢大鼠血清性激素及卵巢腫瘤壞死因子α 表達(dá)的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(4):32.

［5］ 吳勇宏，雷 健，柯于鶴，等.冠心通脈膠囊對(duì)冠心病心絞痛患者白細(xì)胞介素6 和腫瘤壞死因子α 的影響［J］.中醫(yī)臨床研究，2014，1(4):12.

［6］ 費(fèi)志醫(yī).剖宮產(chǎn)術(shù)中發(fā)現(xiàn)卵巢多發(fā)性卵泡囊腫58 例臨床分析［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2010，31(21):3432.

［7］ 余 帆.肥胖型多囊卵巢綜合征患者血清炎癥因子的變化及二甲雙胍干預(yù)效果的臨床研究［J］.中國(guó)婦幼保健，2011，26(25):3878.

［8］ lks CM，F(xiàn)rancis J.Central adiposity，systemic inflammation，and the metabolic syndrome［J］.Curr Hypertens Rep，2010，12(2):99.

［9］ Guzelmeric K，Alkan N，Pirimoglu M，et al.Chronic inflammation and elevated homocysteine levels are associated with increased body mass index in women with polycystic ovary syndrome［J］.Gynecol Endocrinol，2009，23(9):505.

［10］ Benson S，Janssen OE，Hahn S，et al.Obesity，depression，and chronic low－grade inflammation in women with polycystic ovary syndrome［J］.Brain Behav Immun，2008，22(2):177.