雷公藤多苷通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制小鼠結(jié)腸炎癥

朱 靈 周 軍 曹海軍 鐘繼紅 劉 軍 胡華軍 李善高#

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科1(310006) 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科2中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)教研室3

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，病情易反復(fù)發(fā)作，難以治愈，且至今仍缺乏特效且不良反應(yīng)少的治療藥物。UC發(fā)病機制不明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與腸黏膜免疫反應(yīng)異常有關(guān)［1-2］。雷公藤多苷是提取自衛(wèi)矛科植物雷公藤的苷類制劑，具有較強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［3］。臨床實踐中，雷公藤多苷對UC具有良好的療效，但確切機制不明。本實驗采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型以模擬人類UC，并予雷公藤多苷干預(yù)，旨在探討雷公藤多苷對UC的治療作用及其可能機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

健康雄性BALB/c小鼠60只，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(浙)2003-2003。右旋DSS(Sigma-Aldrich Co.LLC.)使用時配制成濃度5%的溶液(5 mg DSS溶于100 mL蒸餾水中);雷公藤多苷片(國藥準(zhǔn)字Z33020422，浙江得恩德制藥有限公司)使用時根據(jù)人和小鼠體表面積換算用藥劑量，以蒸餾水配制成低、中、高濃度混懸液(0.45、1.35、4.05 mg/mL);TRIzol?試劑、SuperScript?Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶、AmpliTaq?PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.);Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)小鼠單克隆抗體(Abcam plc.);EnVision二步法免疫組化試劑盒(DAKO公司);NF-κB p65兔多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.);小鼠白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-13 ELISA 試劑盒(R＆D Systems，Inc.)。

二、方法

1.實驗動物分組和處理:小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為6組，分別為模型對照組，低、中、高劑量雷公藤多苷組、空白對照組和正常對照組，每組10只。第1周模型對照組和各組雷公藤多苷組自由飲用5%DSS溶液，同時每天一次以蒸餾水0.2 mL/10 g或相應(yīng)濃度雷公藤多苷混懸液0.2 mL/10 g灌胃［雷公藤多苷劑量分別為9.01、27.03、81.09 mg/(kg·d)］，空白對照組和正常對照組自由飲用純凈水。造模過程中每天觀察、記錄小鼠糞便性狀、精神、活動情況、體質(zhì)量等。第8天每組隨機取1只小鼠處死，用于觀察結(jié)腸組織大體形態(tài)和組織病理學(xué)改變。模型建立成功與否根據(jù)稀便、糞便帶血、體質(zhì)量減輕等癥狀以及結(jié)腸組織病理學(xué)改變綜合判定。第2～3周，各組小鼠均自由飲用純凈水，模型對照組和各組雷公藤多苷組繼續(xù)每天一次以蒸餾水或相應(yīng)濃度雷公藤多苷混懸液灌胃。第22天，除正常對照組外，各組小鼠均腹腔注射脂多糖(LPS)100μg(用以激活 TLR4/NF-κB信號通路，啟動下游炎癥因子釋放)，24 h后處死，取結(jié)腸組織，觀察大體形態(tài)，取肉眼病變最明顯處行相關(guān)檢測。

2.結(jié)腸組織病理學(xué)檢查:肉眼觀察結(jié)腸組織黏膜和漿膜面變化，取肉眼病變最明顯處結(jié)腸組織約1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，4%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，3～4μm厚連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并行組織病理學(xué)評分［4］。

3.RT-PCR檢測TLR4 mRNA表達(dá):以TRIzol?試劑提取結(jié)腸組織總RNA，紫外分光光度法測定濃度和純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以之為模板行PCR擴增，操作按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。小鼠TLR4引物序列:5’-CAC CTG GGG CTC TGC TAT GGA-3’，5’-CCC CTG GAA AGG AAG GTG TC-3’。PCR反應(yīng)條件:95℃ 1 min;95℃ 10 s，64℃ 25 s，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物行 l%瓊脂糖凝膠電泳，GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)成像，TLR4 mRNA相對表達(dá)量以內(nèi)參β-actin進(jìn)行校正。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測TLR4蛋白表達(dá):結(jié)腸組織勻漿后加入蛋白裂解液和PMSF提取總蛋白，測定總蛋白含量。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染色、去離子水震蕩去除浮色，5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜，加入TLR4小鼠單克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，洗滌后加入二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h，洗滌后加入底物孵育，取出硝酸纖維素膜，蒸餾水漂洗后晾干，UVI凝膠成像系統(tǒng)測定蛋白條帶灰度值，分析TLR4蛋白相對表達(dá)量。

5.免疫組化染色檢測NF-κB p65表達(dá):采用EnVision二步法。結(jié)腸組織切片脫蠟，水化，熱修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;加入NF-κB p65兔多克隆抗體，孵育60 mim，蒸餾水漂洗，置于PBS中;加入山羊抗兔IgG-HRP多聚體，孵育40 min，蒸餾水漂洗，置于PBS中;DAB顯色3 min，顯微鏡下控制反應(yīng)，自來水沖洗終止反應(yīng);蒸餾水漂洗，復(fù)染，封片。胞質(zhì)和(或)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕色顆粒判定為陽性細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞比率與陽性染色強度行免疫組化評分(IHC評分)［5］。

6.ELISA 法檢測 IL-1α、TNF-α、IL-13 濃度:結(jié)腸組織切成2～3 mm3的小塊，放入組織勻漿器中，加入適量PBS，冰上研磨，研磨產(chǎn)物12000×g 4℃離心15 min，取上清液分裝，-80℃保存待測。按相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定結(jié)腸組織勻漿上清中的 IL-1α、TNF-α、IL-13 濃度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

造模過程中無動物死亡。造模第3天，模型對照組和雷公藤多苷組小鼠出現(xiàn)少動、進(jìn)食少、毛色失去光澤、精神倦怠以及不同程度的腹瀉、肉眼便血、肛門血染，體質(zhì)量明顯下降，各組雷公藤多苷組上述表現(xiàn)均輕于模型對照組;空白對照組和正常對照組未觀察到上述異常表現(xiàn)。

二、結(jié)腸組織病理學(xué)改變

造模第8天，模型對照組可見結(jié)腸黏膜充血水腫，中性粒細(xì)胞浸潤。實驗結(jié)束后，模型對照組可見黏膜潰瘍，結(jié)腸肉芽組織增生，潰瘍周邊腺體可見增生，黏膜和黏膜下層以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等慢性炎性細(xì)胞浸潤為主;各組雷公藤多苷組結(jié)腸黏膜均未見潰瘍，結(jié)腸組織水腫充血，少量慢性炎性細(xì)胞浸潤，中、高劑量組上述病理改變輕于低劑量組;空白對照組和正常對照組結(jié)腸黏膜完整、光滑，腺體層次清楚，未見糜爛、潰瘍、炎性細(xì)胞浸潤等改變(圖1)。各組雷公藤多苷組、空白對照組和正常對照組結(jié)腸組織病理學(xué)評分均顯著低于模型對照組(P＜0.05)，中、高劑量雷公藤多苷組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，均顯著低于低劑量組(P＜0.05)，但仍高于空白對照組和正常對照組(P＜0.01)(表1)。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×100)

三、結(jié)腸組織TLR4表達(dá)

RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，各組雷公藤多苷組、空白對照組和正常對照組結(jié)腸黏膜組織TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于模型對照組(P＜0.01);中、高劑量雷公藤多苷組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，均顯著低于低劑量組(P＜0.01)，但仍高于空白對照組和正常對照組(P＜0.01)(圖2)。

四、結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)和定位

NF-κB p65免疫組化陽性物質(zhì)主要定位于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)元細(xì)胞等。正常對照組和空白對照組結(jié)腸黏膜組織NF-κB p65為弱陽性表達(dá)，兩組間IHC評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);模型對照組和各組雷公藤多苷組結(jié)腸黏膜上皮、黏膜下層NF-κB p65呈強陽性表達(dá)，以胞核表達(dá)為主，炎癥黏膜上皮區(qū)表達(dá)強度遠(yuǎn)高于非炎癥黏膜上皮區(qū)，此現(xiàn)象在模型對照組尤為明顯，其IHC評分顯著高于各組雷公藤多苷組(P＜0.01);中、高劑量雷公藤多苷組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，均顯著低于低劑量組(P＜0.01)(圖3、表1)。

五、結(jié)腸組織 IL-1α、TNF-α、IL-13 含量

各組雷公藤多苷組、空白對照組和正常對照組結(jié)腸黏膜組織勻漿上清中的IL-1α、TNF-α含量均顯著低于模型對照組(P＜0.01)，中、高劑量雷公藤多苷組間IL-1α含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，TNF-α含量高劑量組顯著低于中劑量組(P＜0.01)，中、高劑量組IL-1α、TNF-α含量均顯著低于低劑量組(P＜0.05)，但仍高于空白對照組和正常對照組(P＜0.05);各組間IL-13含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA(A)和TLR4蛋白(B)表達(dá)

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)(免疫組化EnVision二步法，×200)

表1各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分、NF-κB p65 IHC評分以及IL-1α、TNF-α、IL-13含量比較)

表1各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分、NF-κB p65 IHC評分以及IL-1α、TNF-α、IL-13含量比較)

與模型對照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05;與空白對照組和正常對照組比較，cP＜0.01，dP＜0.05各組雷公藤多苷組間比較:與低劑量組比較，eP＜0.01，fP＜0.05;與中劑量組比較，gP＜0.01，hP＜0.05

討 論

迄今為止，UC的病因和發(fā)病機制仍未明確，主流觀點認(rèn)為UC是免疫、遺傳、環(huán)境、腸道菌群等多種因素共同作用的結(jié)果，免疫功能紊亂是UC的重要致病因素之一［1-2］。臨床常用的UC治療藥物主要包括氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但用于維持緩解治療時存在諸多不良反應(yīng)且復(fù)發(fā)率較高，難以長期使用。尋找高效、低不良反應(yīng)、能長期使用的UC維持緩解治療藥物迫在眉睫。

雷公藤多苷是中藥雷公藤的有效成分，具有很強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能抑制多種細(xì)胞因子表達(dá)，如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-23、TNF-α等［3，6-7］。研究顯示雷公藤多苷能有效抑制結(jié)腸炎動物模型的腸道炎癥反應(yīng)和組織學(xué)損傷［6-7］，但其具體作用機制尚未完全闡明。

近年來，TLRs在炎癥性腸病(IBD)中的作用逐漸成為IBD研究領(lǐng)域的一大熱點。模式識別受體(PRRs)TLRs是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其可識別并結(jié)合多種類型的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，繼而激活相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致效應(yīng)分子表達(dá)、分泌，從而針對不同外界刺激產(chǎn)生特定的生物學(xué)功能。TLR4是第一個被發(fā)現(xiàn)的TLRs，其主要負(fù)責(zé)識別革蘭陰性菌胞壁成分LPS，啟動相關(guān)信號通路，最終導(dǎo)致NF-κB激活及其下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)。研究顯示TLR4在IBD患者的結(jié)腸炎癥黏膜中呈異常高表達(dá)，在非炎癥黏膜中的表達(dá)則與對照者無明顯差異［8-10］，而正常人腸上皮細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平極低且不表達(dá)TLR4信號通路中的關(guān)鍵共受體MD-2，故正常腸黏膜對腸道革蘭陰性共生菌的LPS呈低反應(yīng)性，不由此激活 NF-κB，引起炎癥反應(yīng)［11］。另有研究［12］發(fā)現(xiàn)，TLR4拮抗劑可阻斷LPS刺激引起的促炎基因表達(dá)，抑制小鼠模型的結(jié)腸炎癥。上述研究結(jié)果均表明TLR4及其介導(dǎo)的信號通路是UC發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)之一。

NF-κB為一普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，主要由p65和p50兩個亞單位結(jié)合成二聚體或異二聚體，其中p65為其主要功能亞單位，具有顯著促炎活性。靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與抑制蛋白IκBα形成復(fù)合體，以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中;細(xì)胞接收外界刺激信號后，IκBα被磷酸化而從復(fù)合體脫落，游離的NF-κB易位至細(xì)胞核內(nèi)，與靶DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)下游促炎基因表達(dá)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等釋放，這些細(xì)胞因子又進(jìn)一步激活NF-κB，形成正反饋調(diào)節(jié)，使炎癥反應(yīng)放大［13］。大量研究表明，TLR4/NF-κB 信號通路在UC中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，雷公藤多苷對UC腸道炎癥的抑制作用是否與抑制該信號通路有關(guān)，相關(guān)文獻(xiàn)報道尚少。

本實驗予小鼠自由飲用5%DSS溶液成功復(fù)制了與人類UC類似的結(jié)腸炎動物模型，同時予不同劑量雷公藤多苷干預(yù)，通過檢測結(jié)腸炎癥黏膜組織中的TLR4、NF-κB p65表達(dá)以及促炎細(xì)胞因子 IL-1α、TNF-α和抗炎細(xì)胞因子IL-13分泌，探討雷公藤多苷對UC的治療作用及其可能機制。實驗結(jié)果顯示，模型對照組和各組雷公藤多苷組結(jié)腸黏膜組織TLR4、NF-κB p65 表達(dá)和 IL-1α、TNF-α 分泌均顯著高于僅予LPS刺激的空白對照組和不予任何處理的正常對照組，且表達(dá)變化與結(jié)腸組織病理學(xué)改變基本一致，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道相符［6，8-10，14-15］，其可能機制為:模型小鼠腸道黏膜免疫反應(yīng)異常，TLR4/NF-κB信號通路被LPS激活，釋放各種炎癥因子如IL-1α、TNF-α等，引發(fā)結(jié)腸炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷。而空白對照組和正常對照組結(jié)腸黏膜組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)和促炎細(xì)胞因子分泌均處于低水平狀態(tài)，與正常腸道黏膜的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)(對TLR4配體LPS處于長期免疫耐受狀態(tài))有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎模型小鼠經(jīng)雷公藤多苷干預(yù)后，結(jié)腸黏膜組織 TLR4、NF-κB p65 表達(dá)和 IL-1α、TNF-α分泌均顯著下降，結(jié)腸組織病理學(xué)改變相應(yīng)減輕，以中、高劑量組為著，表明雷公藤多苷對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有良好的保護(hù)作用，其防治UC發(fā)生、發(fā)展的作用在一定范圍內(nèi)與用藥劑量有關(guān)。本實驗中雷公藤多苷干預(yù)對結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜組織抗炎細(xì)胞因子IL-13分泌無明顯影響，表明雷公藤多苷對UC的保護(hù)作用并非通過調(diào)控抗炎細(xì)胞因子表達(dá)、分泌而實現(xiàn)。

綜上所述，根據(jù)本實驗研究結(jié)果，雷公藤多苷對DSS小鼠結(jié)腸炎有良好的保護(hù)作用，其可能通過抑制結(jié)腸黏膜組織TLR4表達(dá)，進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB信號通路激活及其下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)、分泌而抑制結(jié)腸炎癥反應(yīng)。后續(xù)將進(jìn)一步研究雷公藤多苷抑制TLR4/NF-κB信號通路的具體分子機制，確定該信號通路中的關(guān)鍵分子以及雷公藤多苷的最適劑量，為臨床上應(yīng)用雷公藤多苷治療UC提供實驗依據(jù)。

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