針刺捻轉(zhuǎn)補瀉手法對自發(fā)性高血壓大鼠RAS的影響

田艷鵬 王朝陽 孫靜文 金娜美 郭 妍 劉清國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029)

高血壓作為一種常見的心腦血管疾病，具有較高的發(fā)病率和致死率，嚴重危害著人類的健康。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人類生活水平的提高，以及體力活動的逐漸缺乏，超重肥胖率不斷增高。此外，當今社會生活和工作壓力大，應(yīng)酬增多，飲食結(jié)構(gòu)嚴重不合理，吸煙、飲酒也成為許多人生活中不可或缺的一部分。研究表明，較大的生活心理壓力、肥胖、吸煙、酗酒以及不合理的飲食均與高血壓的發(fā)生有著不可分割的關(guān)系。治療高血壓要以最大限度地降低心腦血管病的病死率和致殘率為目標。降壓藥物的應(yīng)用以及采用非藥物方法如控制體重、限鹽、限酒以及增加體力活動等，使血壓水平得到一定程度的控制，但與血壓密切相關(guān)的其他心腦血管疾病如心衰、心梗、腦卒中和腎臟疾病等的發(fā)病率卻沒有明顯下降，相反，部分疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，究其原因是由于血壓控制不理想和未重視對靶器官的保護。所以尋找一種能夠有效降低血壓水平并能保護靶器官的治療方法迫在眉睫。

課題組前期已進行了大量的研究，探討捻轉(zhuǎn)補瀉手法對血壓調(diào)控的可能機制，證實了針刺治療高血壓的有效性以及捻轉(zhuǎn)補法和瀉法生物效應(yīng)的差異性。如王麗等［1］發(fā)現(xiàn)針刺瀉法可使應(yīng)激性高血壓大鼠血清去甲腎上腺素(Noradrenaline，NE)、5-羥色胺(5-Hydroxy Tryptamine，5-HT)含量下降，血漿及下丘腦內(nèi)皮素(Endothelia，ET)含量下降，認為針刺對應(yīng)激性高血壓大鼠血壓的調(diào)節(jié)與中樞和外周ET、血清NE、5-HT含量變化有關(guān)，其機制是外周交感神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮功能系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。但有關(guān)捻轉(zhuǎn)補瀉手法對高血壓靶器官保護作用機制的研究尚不夠充分。本實驗通過觀察針刺捻轉(zhuǎn)補瀉手法對SHR大鼠血漿及腎組織中腎素、AngⅡ的影響，探討捻轉(zhuǎn)補瀉手法對高血壓腎損害的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性12周齡SHR大鼠60只，WKY大鼠12只，體重200～250 g，均購于北京維通利華實驗動物養(yǎng)殖中心(清潔級)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院動物室。

1.1.2 實驗器材 中研太和牌一次性無菌毫針0.16 mm×7 mm，無錫佳健醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn);動物無創(chuàng)血壓測試儀(BP-6)，成都泰盟生物儀器有限公司提供;ELISA定量檢測試劑盒(腎素、AngⅡ)，慧佳生物科技有限公司提供。

1.2 動物分組 按照隨機數(shù)字表，將SHR大鼠60只隨機分為5組，每組12只，分別為模型對照組(A)、針刺留針組(B)、捻轉(zhuǎn)補法組(C)、捻轉(zhuǎn)瀉法組(D)、平補平瀉組(E)。WKY大鼠12只作為空白對照組F。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.3 取穴及干預(yù)方法

1.3.1 取穴 選取太沖穴作為針刺穴位，于后肢足背1、2 趾骨間凹陷處取穴(《實驗針灸學(xué)》［2］)。

1.3.2 干預(yù)方法 實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始治療。將各組大鼠放入提前準備好的鼠袋中，露出雙側(cè)后肢，直刺單側(cè)太沖穴1～2 mm，每日左右兩側(cè)交替針刺。治療周期為28 d，每日上午治療1次，時間集中在8:00—11:00，每隔6 d休息1 d，共治療24次，所有針刺操作由專人負責完成。施行手法時，以節(jié)拍器輔助控制捻針頻率和時間，將節(jié)拍器發(fā)音頻率設(shè)定為:1 min，60次/min。針刺處理方法如下:A、F組:只做與其他組相同的抓取刺激，不做針刺處理。B組:針刺“太沖穴”，留針10 min，期間不做任何處理。C組:針刺“太沖穴”并用捻轉(zhuǎn)補法，以右手為刺手，大拇指作用力向前用力捻轉(zhuǎn)，然后輕力退回，捻轉(zhuǎn)幅度 360°/次，60次/min，持續(xù)捻針2 min，留針10 min。D組:針刺“太沖穴”并用捻轉(zhuǎn)瀉法，以右手為刺手，大拇指作用力向后時用力捻轉(zhuǎn)，然后輕力向前退回，捻轉(zhuǎn)幅度360°/次，60次/min，持續(xù)捻針2 min，留針10 min。E組:針刺“太沖穴”并用平補平瀉法，以右手為刺手，大拇指向前捻轉(zhuǎn)和向后捻轉(zhuǎn)作用力相同，捻轉(zhuǎn)幅度360°/次，60次/min，持續(xù)捻針2 min，留針 10 min。

1.4 指標檢測

1.4.1 測量血壓 室溫(22±2)℃條件下，將無創(chuàng)血壓儀預(yù)熱，并恒定在35℃(用溫控器調(diào)節(jié)溫度恒定)約15 min，測量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓和舒張壓，連續(xù)測量3次，取其均值。測量時間點:針刺前1天和針刺治療開始后的第3、6、10、13、17、20、24、27天。正式測壓前訓(xùn)練若干次。測壓過程注意事項:操作者動作輕柔，以免因激惹大鼠而導(dǎo)致其血壓波動;實驗室環(huán)境要保持安靜;加溫時間不能太長，要固定在15 min左右;大鼠網(wǎng)套及尾套尺寸大小均要合適，以防逃脫。測量過程中由于溫度控制不當，導(dǎo)致空白組大鼠死亡2只。

1.4.2 腎素、AngⅡ的測定 動物清醒狀態(tài)下，斷頭，取10 mL抗凝管接取主動脈血5 mL，靜置30 mim后，于4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-20℃下保存待測定。采用ELISA法測定血漿中腎素、AngⅡ。操作程序嚴格按說明書進行。動物斷頭后，暴露腹腔，迅速摘取右側(cè)腎臟，修塊，4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，在冰浴中制成勻漿，4℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液。采用ELISA法測定腎組織中腎素、AngⅡ。操作程序嚴格按說明書進行。1.4.3 腎組織病理學(xué)觀察 動物斷頭后，暴露腹腔，迅速剪取大鼠左側(cè)腎臟，修塊，用10%中性甲醛液固定24 h，然后分別用乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋切片4～5μm，伊紅和蘇木精(HE)染色，光鏡觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計方法 實驗結(jié)果采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示。組間差異如方差齊則采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后各組大鼠血壓的變化 治療前SHR組大鼠收縮壓和舒張壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與F組比較，SHR組大鼠收縮壓和舒張壓均顯著升高(P＜0.01)。治療28 d后，F(xiàn)組大鼠收縮壓升高，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而舒張壓與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);A組大鼠收縮壓與舒張壓與治療前、B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);B、C、E組大鼠治療前后收縮壓和舒張壓無明顯變化(P＞0.05);D組大鼠收縮壓和舒張壓與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，與 A、B、C、E、F 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表3 針刺對腎組織中腎素、AngⅡ含量的影響(ˉx±s，pg/mg)

表1 各組大鼠血壓的變化(ˉx±s，mmHg)

表2 針刺對血漿中腎素、AngⅡ含量的影響(ˉx±s，ng/L)

2.2 血漿中腎素、AngⅡ含量的變化 血漿腎素含量，A組與F組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組血漿腎素含量明顯降低，與A、B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與F組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。血漿AngⅡ含量，A組與F組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組血漿AngⅡ含量明顯降低，與A、B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與F組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

圖1 HE染色法觀察腎組織病理學(xué)變化(×200)

2.3 腎組織中腎素、AngⅡ含量的變化 腎組織腎素含量，A組與F組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組腎組織腎素含量明顯降低，與A、B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與F組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。腎組織AngⅡ含量，A組與F組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D組腎組織AngⅡ含量明顯降低，與A、B、C、E組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與F組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.4 腎組織病理學(xué)變化 光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理學(xué)切片，F(xiàn)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常。A與B、C、E組均有不同程度腎小球系膜基質(zhì)增生，腎小球硬化;腎小管基膜不規(guī)則增厚，并出現(xiàn)萎縮;腎間質(zhì)纖維化;腎小動脈管壁增厚。且A組病變程度較其他各組略重。D組血管結(jié)構(gòu)基本正常，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。見圖1。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin System，RAS)是人體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，由多種激素和相關(guān)的酶類組成。它的主要功能是調(diào)節(jié)人體血壓、水和電解質(zhì)的平衡，保持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。循環(huán)和組織中都有RAS的存在，兩者均能參與對靶器官的調(diào)節(jié)。隨著研究的深入和分子生物學(xué)的進展，進一步證實了在心臟、腎臟、腎上腺、腦以及周圍血管中均有組織RAS存在［3］，使得人們對RAS在高血壓發(fā)病中的作用有了更深入的了解。

高血壓的發(fā)生與循環(huán) RAS分泌過多有關(guān)［4］。局部RAS分泌后，通過自分泌、旁分泌的方式在局部組織細胞中發(fā)揮作用。過度激活的RAS與高血壓的發(fā)生、發(fā)展以及心血管肥大和重構(gòu)密切相關(guān)［5］。

AngII在RAS中發(fā)揮著重要作用。RAS通過AngII強有力的縮血管作用和醛固酮(ALD)的水、鈉潴留作用，在高血壓形成機制中發(fā)揮重要作用［6］。AngII引起血壓升高的途徑有:1)直接作用于血管緊張素受體(AT1)，使小動脈平滑肌收縮;2)刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶，使醛固酮分泌增加，增加水鈉潴留;3)刺激交感神經(jīng)末梢，使去甲腎上腺素分泌增加等［7］。AngII不僅具有收縮血管的作用，并可通過氧化激活和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)高血壓發(fā)生［8-9］。此外，血壓的晝夜節(jié)律模式受血漿腎素活性和醛固酮水平的影響［10］，而血漿腎素活性和醛固酮水平還可能參與高血壓靶器官的損害［11］。腎臟既是調(diào)節(jié)血壓的重要器官，又是高血壓的主要靶器官之一。高血壓病早期即存在腎小管近端重吸收功能損害［12］。長期高血壓又可以導(dǎo)致腎小動脈及微動脈硬化，管壁增厚、管腔狹窄，最終造成腎小球硬化和間質(zhì)纖維化［13］，直至尿毒癥而死亡。AngII可以直接收縮腎小動脈，增加腎小球毛細血管阻力，還可作用于腎小球血管間質(zhì)細胞上的AT1受體，使轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)的表達增加，平滑肌增生，或促進腎小球血管間質(zhì)細胞的增生和基質(zhì)的生成，最終導(dǎo)致腎小球的損傷和硬化?？梢姡珹ngII是高血壓引起腎小球硬化的主要因子［14］。

本實驗通過觀察針刺捻轉(zhuǎn)補瀉對SHR大鼠RAS的影響，探討捻轉(zhuǎn)補瀉手法對SHR大鼠腎臟保護的作用機制。實驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論:捻轉(zhuǎn)瀉法能有效地降低12周齡SHR大鼠血壓水平，降低SHR大鼠血漿及腎組織腎素、AngⅡ的含量;捻轉(zhuǎn)瀉法能有效降低SHR大鼠血壓水平，減輕高血壓腎損害，其作用機制可能是:捻轉(zhuǎn)瀉法能夠有效降低SHR大鼠血漿及腎組織腎素、AngⅡ含量，減少RAS在高血壓腎損害中發(fā)揮作用;本實驗所采用的捻轉(zhuǎn)補瀉手法存在效應(yīng)的差異。腎小球入球動脈的球旁細胞分泌腎素，激活從肝臟產(chǎn)生的血管緊張素原，生成Ang I，然后經(jīng)肺循環(huán)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用，生成AngII。這是AngII生成的“經(jīng)典通路”，也是循環(huán)AngII的主要來源。有研究表明［15］，SHR大鼠AngII顯著升高。實驗中發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠血漿腎素水平顯著升高，可以推斷由于SHR大鼠血漿腎素水平升高，經(jīng)過上述經(jīng)典通路可以最終導(dǎo)致AngII含量升高，而AngII是導(dǎo)致SHR大鼠血壓升高最主要的效應(yīng)物質(zhì)。所以通過調(diào)整血漿腎素水平可以間接對血壓水平實施控制。實驗中還發(fā)現(xiàn)，針刺捻轉(zhuǎn)瀉法可以有效降低SHR大鼠血漿腎素水平。而與捻轉(zhuǎn)補法組、平補平瀉組、針刺留針組比較，模型組對照組大鼠血漿腎素水平明顯升高(P＜0.01)，在前期理論的基礎(chǔ)上，進一步證實了針刺具有使機體功能亢進者降低，低下者增高，不平衡者趨于相對平衡的良性調(diào)節(jié)作用。由于SHR大鼠血漿腎素水平升高，所以針刺具有使其降低的作用，但皆不如捻轉(zhuǎn)瀉法效果好，這是因為本實驗所采用的SHR大鼠基本符合中醫(yī)肝陽上亢的特征，屬實證，故瀉法降低血漿腎素水平的效果最好。實驗中發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠腎組織腎素水平也顯著升高，捻轉(zhuǎn)瀉法能夠有效地降低SHR大鼠腎組織腎素水平。說明血壓的升高與腎組織腎素水平也有一定的關(guān)系?？梢姡I組織RAS不僅與局部組織的生長和分化密切相關(guān)［16］，還可能參與了對血壓的調(diào)控。實驗還發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠血漿AngII水平明顯升高，這與以往大多數(shù)實驗研究結(jié)果相符。如前所述，腎組織RAS不僅能夠調(diào)節(jié)局部組織的生長和分化，可能還參與了對血壓的調(diào)控。腎組織RAS存在于腎小管、腎小動脈和直血管。由近端腎小管產(chǎn)生腎素，經(jīng)腎小管腔或間質(zhì)被攝取，進入近端腎小管細胞胞漿。腎組織RAS對腎功能的調(diào)節(jié)具有重要作用。AngII首先作用于近端腎小管近端的AngII受體，調(diào)節(jié)鈉的吸收和PH，對鈉的自體穩(wěn)定具有重要作用。而在血管部位的RAS則影響腎小球的血流動力學(xué)以及腎小管、腎小球的反饋機制。腎血流減少時，AngII優(yōu)先使輸出小動脈收縮，增加腎小球的靜水壓和濾過率，從而腎小球的濾過率保持相對穩(wěn)定。實驗發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠腎組織AngII水平明顯升高，而捻轉(zhuǎn)瀉法能有效降低SHR大鼠腎組織AngII水平，與預(yù)期結(jié)果相符。與捻轉(zhuǎn)補法組、平補平瀉組、針刺留針組比較，模型對照組大鼠腎組織AngII水平顯著升高(P＜0.01)?？梢?，血壓的升高與循環(huán)和組織中RAS的激活有關(guān)，而針刺對血壓的調(diào)節(jié)和對靶器官的保護作用也與RAS系統(tǒng)密切相關(guān)。

綜上所述，針刺捻轉(zhuǎn)瀉法能夠有效地降低SHR大鼠血壓水平、血漿及腎組織腎素、AngⅡ含量，減輕高血壓腎損害。在高血壓的治療過程中，減少高血壓靶器官損害至關(guān)重要，本實驗僅從SHR大鼠RAS的變化來探討捻轉(zhuǎn)補瀉手法對高血壓靶器官損害的保護作用機制，更多的作用機制尚需進一步探索。本研究的創(chuàng)新點在于將研究捻轉(zhuǎn)補瀉手法的降壓效應(yīng)，擴展到研究捻轉(zhuǎn)補瀉手法同時具有保護和逆轉(zhuǎn)靶器官損害的作用，為探索新的高血壓防治靶點提供理論依據(jù)。

［1］王麗，支建梅，王朝陽，等.捻轉(zhuǎn)補瀉手法對應(yīng)激性高血壓大鼠ET、NE 和5-HT 的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，37(10):681-685.

［2］林文注，王佩.實驗針灸學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1994:287.

［3］李國紅，丁金風，張琪.血管緊張素II促高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖機制的研究［J］.中華心血管病雜志，1995，23(6):449-452.

［4］Crowley SD，Gurley SB，Herrera MJ，et al.AngiotensinIIcauses hypertension and cardiac hypertrophy through its receptors in the kidney［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(47):17985-17990.

［5］林杰，田海宏.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2與高血壓［J］.心血管病學(xué)進展，2009，30(1):69-71.

［6］陳曉琦.原發(fā)性高血壓的病因［J］.醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)資訊，2005，2(15):1.

［7］Turoni CJ，Maranon RO，Proto V，et al.Nitric oxide modulates reactivity to angiotensin II in internal mammary arterial grafts in hypertensive patients without associated risk factors［J］.Clin Exp Hypertens，2011，33(1):27-33.

［8］Liao TD，Yang XP，Lin YH，et a1.Role of inflammation in the development of renal damage and dysfunction in angiotensinII-induced hypertension［J］.Hypertension，2008，52(2):256-263.

［9］Liu M，Guo Y.Effects of renin-angiotensin-aldosterone system on circadian rhythm of blood pressure［J］.Advances in Cardiovascular Diseases，2006，27(4):499-501.

［10］Giles TD.Factors affecting circadian variability［J］.Blood Press Monit，2000，5(suppl 1):S3-7.

［11］蔣禮，張玲，殷躍輝，等.原發(fā)性高血壓病對早期腎功能的影響［J］.臨床醫(yī)學(xué)，2007，27(2):1-3.

［12］裴芳，李小鷹，方穎，等.老年原發(fā)性高血壓左心室肥厚患者心腎微動脈的病理特征［J］.中華心血管病雜志，2008，36(10):872-877.

［13］孫海燕.腎素-血管緊張素在高血壓發(fā)病機制及藥物治療中的作用［J］.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2005，8(2):44-47.

［14］楊華元，鐘小紅，劉堂義，等.針刺仿真手法對高血壓大鼠血壓及心肌血管緊張素 II的影響［J］.針刺研究，2008，33(3):186-189.

［15］Dzau VJ.Circulating versus local renin angiotensin system in cardiovascular homeostasis［J］.Circulation，1998，77(suppl 1):14-13.