以基因芯片探究針刺瀉法對(duì)應(yīng)激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達(dá)的影響

紀(jì)　智，郭　文，朱華超，謝曉佳，孫啟勝，劉清國(guó)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029)

以基因芯片探究針刺瀉法對(duì)應(yīng)激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達(dá)的影響

紀(jì)智，郭文，朱華超，謝曉佳，孫啟勝，劉清國(guó)*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029)

摘要：目的運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)針刺瀉法對(duì)應(yīng)激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達(dá)的影響并分析其內(nèi)在機(jī)理。方法雄性Wistar大鼠27只，隨機(jī)分為空白組、模型組、模型+針刺瀉法組，每組9只。造模方法：噪聲結(jié)合足底電擊刺激，周期為14 d。造模同時(shí)針刺瀉法組取曲池穴、太沖穴進(jìn)行干預(yù)，模型組和空白組每天做與針刺組相同的抓取刺激。在造模前1天、第3、5、7、9、11、13、15天測(cè)量大鼠的血壓，并觀察其生理學(xué)行為學(xué)改變。第15天量取血壓后取材，用Rat Gene 2.0 Array technology進(jìn)行基因芯片分析。結(jié)果造模期間空白組血壓始終保持正常水平。模型組在造模第3天即突破了120 mmHg(P<0.01)，并在后來(lái)的第5、7、9、11、13、15天持續(xù)升高至較高水平(P<0.01)。造模過(guò)程中大鼠出現(xiàn)尖叫、咬架、小便變黃、毛質(zhì)粗糙、眼睛充血等變化，且血壓始終處于120～139 mmHg范圍內(nèi)，說(shuō)明造模成功。模型+針刺瀉法組的血壓值在第5、7、9、11、13、15天均明顯低于模型組。基因表達(dá)頻譜結(jié)果顯示：與模型組相比，模型+針刺瀉法組有106個(gè)基因表達(dá)升高，92個(gè)基因表達(dá)降低。其中高血壓相關(guān)基因CYP1A1、IGFBP-1的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)變化。結(jié)論針刺太沖、曲池并施以瀉法，可明顯降低應(yīng)激性高血壓前期大鼠的血壓，并影響其腎臟的基因表達(dá)。

關(guān)鍵詞：針灸療法；瀉法；應(yīng)激性高血壓前期；基因芯片

應(yīng)激性高血壓[ 1]的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，其內(nèi)在機(jī)制主要包含下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)[2 ]，腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAS)[3 ]，交感神經(jīng)—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SAM)[4 ]。美國(guó)JNC7中提出“高血壓前期”(120～139/80～89 mmHg)的概念，旨在引起醫(yī)務(wù)人員和公眾對(duì)于高血壓前期這一特殊階段的重視[5 ]。因?yàn)檫@一人群的基數(shù)大，進(jìn)展至高血壓的比例高，罹患冠心病、腦卒中與終末期腎病的概率大，并已經(jīng)出現(xiàn)了靶器官的損傷和相應(yīng)基因和蛋白的表達(dá)的改變[6 ]。研究[7-8 ]表明，針刺治療對(duì)血壓的降低作用，主要通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。而在本課題組既往多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[ 9-10 ]中發(fā)現(xiàn)，針刺瀉法降血壓的效果最佳，明顯高于針刺補(bǔ)法組和靜留針組。

基因芯片技術(shù)是目前發(fā)展迅速的一項(xiàng)生物技術(shù)，用于檢測(cè)和分析基因表達(dá)。具有高通量、高靈敏性、高效率的特點(diǎn)，可同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)基因。這樣的特點(diǎn)為分析研究受高血壓影響的多個(gè)基因提供了可能[11 ]。之前的研究著重于中后期高血壓的治療和對(duì)靶器官的保護(hù)，少有對(duì)于高血壓前期基因表達(dá)和干預(yù)的研究。本研究將探查針刺瀉法對(duì)應(yīng)激性高血壓前期的調(diào)控作用，并應(yīng)用基因芯片技術(shù)監(jiān)測(cè)重點(diǎn)基因，從基因?qū)用嫦到y(tǒng)地闡釋其作用機(jī)理，從而為針刺預(yù)防和治療高血壓提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用健康成年SPF級(jí)Wistar大鼠27只，雄性，體質(zhì)量(220±30)g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境舒適清潔，通風(fēng)良好，定期紫外線消毒。室溫控制在(20±1)℃，濕度50%，光線模擬自然環(huán)境的12 h晝夜交替。自由進(jìn)食及飲水，每日清掃糞便，更換墊料。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法，利用隨機(jī)數(shù)字表將Wistar大鼠分為空白組、模型組、模型+針刺瀉法3組，每組9只。

1.2動(dòng)物模型制備本實(shí)驗(yàn)采用目前最通行的，電擊足底結(jié)合噪聲刺激的方式，制備應(yīng)激性高血壓大鼠模型。模型組和模型+針刺瀉法組大鼠，每天上午8∶00-10∶00 、下午2∶00-4∶00 各接受1 次電擊足底結(jié)合噪聲應(yīng)激刺激。應(yīng)激時(shí)將動(dòng)物放在(22 cm×22 cm×26 cm) 籠內(nèi)，籠子底部由細(xì)的銅柵構(gòu)成，通過(guò)銅柵給動(dòng)物足底電脈沖刺激，刺激脈沖每2～25 s之間隨機(jī)發(fā)生1次，刺激脈沖電壓為80 V，持續(xù)時(shí)間50 ms/次，電刺激時(shí)由蜂鳴器發(fā)出噪聲(80～100 db，時(shí)程50 ms)。1.3干預(yù)方式將各組大鼠舒適的固定于特質(zhì)鼠套中，露出四肢，固定20 min。針刺瀉法組取太沖穴(雙側(cè))、曲池(雙側(cè))，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材：于后肢足背1、2趾骨凹陷處取太沖穴，直刺1 mm；于橈骨近端，肘關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中取曲池穴，直刺4 mm。采用中研太和牌一次性25號(hào)0.5寸毫針(無(wú)錫佳健醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。以右手為刺手,太沖穴大拇指作用力向后時(shí)用力捻轉(zhuǎn)，然后輕力向前退回，捻轉(zhuǎn)幅度360°/次，60次/min，持續(xù)捻轉(zhuǎn)1 min，10 min后再行針1次，共留針20 min?？瞻捉M和模型組進(jìn)行與針刺瀉法組相同的捉抓刺激。干預(yù)方式，1次/d，由同一人員操作，保持相同干預(yù)方式14 d直至取材。

1.4取材方法及觀測(cè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)第15天量取大鼠尾動(dòng)脈血壓后，將其麻醉后斷頭處死，立即置于冰盤(pán)中剪取雙腎，用液氮快速冷凍固定后存放在-80 ℃冷凍室內(nèi)。于造模結(jié)束2 h后測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，測(cè)試環(huán)境保持(22±2) ℃恒溫。大鼠在36 ℃環(huán)境中預(yù)熱15 min，用無(wú)創(chuàng)血壓儀在大鼠安靜清醒的狀態(tài)下測(cè)取血壓值。每只大鼠測(cè)量3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1天測(cè)量1次，實(shí)驗(yàn)第3、5、7、9、11、13、15 天各測(cè)量1次。應(yīng)用mirVana miRNA isolation Kit技術(shù)從27只大鼠中分別提取RNA。每組樣本應(yīng)用Gene Chip Rat GENE 2.0 ST Array 進(jìn)行基因表達(dá)頻譜分析，并重復(fù)3次。應(yīng)用Affymetrix protocol對(duì)每組樣本進(jìn)行標(biāo)記和芯片雜交。應(yīng)用Affymetrix Gene Chip 645系統(tǒng)進(jìn)行芯片雜交，隨即應(yīng)用Affymetrix Gene Chip 450系統(tǒng)進(jìn)行洗染。最后應(yīng)用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner 進(jìn)行掃描。

1.5數(shù)據(jù)分析將掃描后的CEL格式圖像輸入到Affymetrix Expression console software，對(duì)基因芯片圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Robust Multichip Average 算法對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理和分析。而后將歸一化后得到的CHP格式的數(shù)據(jù)，輸入Transcriptome Analysis console中進(jìn)行下一步分析。通過(guò)比較3組之間基因表達(dá)差異，通過(guò)fold-change值觀察基因上調(diào)或下調(diào)的變化趨勢(shì),其中fold-change值≥1.5的為差異基因。篩選出兩樣本之間差異表達(dá)基因之后，通過(guò)超幾何檢驗(yàn)的方法，進(jìn)行差異表達(dá)基因的Go功能富集分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠收縮壓變化15 d中，空白組大鼠的收縮壓一直處于正常水平。相比之下模型組在造模第3天即突破120 mmHg(P<0.01)，并在后來(lái)的第5、7、9、11、13、15天持續(xù)升高至較高水平(P<0.01)。模型+針刺瀉法組的血壓值上升相對(duì)平緩，在第5、7、9、11、13、15天均明顯低于模型組。說(shuō)明太沖、曲池穴施以針刺瀉法，可有效抑制應(yīng)激性前期高血壓大鼠血壓升高。

2.2各組大鼠基因表達(dá)變化基因表達(dá)頻譜結(jié)果fold change值顯示，與空白組比較，模型組有187個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了變化。其中有99個(gè)基因表達(dá)升高，88個(gè)基因表達(dá)降低。與模型組相比，針刺瀉法干預(yù)改變了198個(gè)基因的表達(dá)，其中有106個(gè)基因表達(dá)升高，92個(gè)基因表達(dá)降低(P<0.05，fold change≥1.5)。基因表達(dá)頻譜結(jié)果顯示，有43個(gè)基因表達(dá)在模型組中升高，在模型+電針組降低；另有34個(gè)基因表達(dá)在模型組中降低，在模型+電針組中升高。

2.3Go功能富集分析本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了Go功能富集分析來(lái)探查在針刺瀉法的干預(yù)下，表達(dá)發(fā)生改變的基因所相關(guān)的生理功能，結(jié)果如圖1所示，包含生理功能和細(xì)胞組分。最終得出與差異基因相關(guān)的功能條目為chemical，stress，stimulus，biotic stimulus，protein folding，external biotic stimulus，extracellular region part，unfolded protein binding，endoplasmic reticulum lumen，external stimulus(富集分值最高的10個(gè)，enrichment值≥10)等。

圖1　Go功能富集分析結(jié)果

3討論

原發(fā)性高血壓中應(yīng)激性高血壓所占比率高達(dá)22.2%，而焦慮、緊張等情緒是造成應(yīng)激性高血壓的主要原因[12 ]。本實(shí)驗(yàn)所采用的電擊足底結(jié)合噪聲刺激的方式，為身體和心理的多重刺激，類似人類生活的多應(yīng)激源環(huán)境，是目前最成熟和通用的應(yīng)激性高血壓模型制作方式。實(shí)驗(yàn)中與空白組相比，模型組大鼠血壓有大幅度升高，且出現(xiàn)跳起、尖叫、咬架、大便硬、小便黃、毛發(fā)粗糙、眼睛充血等變化，符合人類高血壓中肝陽(yáng)上亢的證候表現(xiàn)。這說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)造模成功，也驗(yàn)證了長(zhǎng)期身心壓力可導(dǎo)致血壓升高的理論。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞幱诟哐獕呵捌?，氣陰虧耗尚輕，屬肝陽(yáng)上亢的實(shí)證，故針刺采用瀉法最為適宜。而根據(jù)前期課題研究結(jié)果表明，瀉法組降壓效果明顯優(yōu)于補(bǔ)法組和靜留針組。在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,第5天開(kāi)始針刺瀉法組的血壓相比模型組有明顯下降，與筆者的前期研究結(jié)果一致。曲池、太沖2穴為臨床高血壓治療常用穴，其降壓效果已經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。曲池穴是手陽(yáng)明大腸經(jīng)合穴，“合主逆氣而泄”,且大腸經(jīng)屬金能克肝木，故針刺曲池穴有平肝瀉火的作用。太沖穴為肝之原穴，為“一身氣化發(fā)生之始”“握升降之樞”。具疏肝行氣之功，是治療高血壓病的要穴。曲池、太沖配伍，一臟一腑、一陰一陽(yáng)，共奏調(diào)氣降逆、平肝潛陽(yáng)、柔肝熄風(fēng)之功。

高血壓的發(fā)病與多個(gè)基因相關(guān)，并受到多方面環(huán)境的影響。因此，通過(guò)檢測(cè)所有相關(guān)基因的表達(dá)并分析組間差異的方法，可較系統(tǒng)的分析高血壓的調(diào)控機(jī)制。本研究基因芯片結(jié)果表明模型組與空白組之間，針刺瀉法+模型組與模型組之間的基因表達(dá)，均存在明顯的差異。其中一些基因表達(dá)的差異已被證實(shí)與高血壓相關(guān)。

CYP1A1是CYP基因家族的一員，負(fù)責(zé)合成細(xì)胞色素P450酶[13 ]。IGFBP-1是胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白基因家族中的一員，負(fù)責(zé)合成胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1[14 ]。IGFBP-1蛋白在血漿中循環(huán)，并結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-1，IGF-1與IGFBP-1結(jié)合后，其半衰期得以延長(zhǎng),與細(xì)胞表面受體的相互作用也發(fā)生改變。研究[15 ]表明IGF-1是一種心血管疾病的保護(hù)因子,可通過(guò)誘導(dǎo)一氧化氮(NO)的合成，從而產(chǎn)生舒張血管的功能。高血壓患者血清IGF-1濃度升高，并隨著血壓水平和病情嚴(yán)重程度更加明顯[16 ]?；蛐酒Y(jié)果表明，CYP1A1、IGFBP-1基因可能是應(yīng)激性高血壓前期的靶基因之一，而針刺瀉法可以抑制CYP1A1、IGFBP-1基因的表達(dá)。針刺瀉法可能通過(guò)干預(yù)CYP1A1、IGFBP-1基因的表達(dá)，起到降壓效果，其具體機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刺太沖、曲池并施以捻轉(zhuǎn)瀉法，可明顯降低應(yīng)激性高血壓前期大鼠血壓值，并影響其腎臟的基因表達(dá)。

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Twirling-reducing needling manipulation on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rats

JI Zhi,GUO Wen,ZHU Huachao,XIE Xiaojia,SUN Qisheng,LIU Qingguo*

(School of Acupuncture,Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of twirling-reducing needling manipulation(TRNM) on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rat by gene chip technology.MethodsTwenty-seven,male Wistar rats were randomly divided into 3 groups (n=9/group):blank control group,model control group and model+TRNM group.Foot-shocks combined with generated noise was applied in the preparation of stress-induced pre-hypertension model and lasted for 14 days.Twirling-reducing needling manipulation was used on Taichong(LR3) and Quchi(LI11) of TRNM group along the molding cycle.The model control and blank control group rats were grabbed in the same restrainers for 20min without any other intervene.Systolic blood pressure(SBP) was tested one day before work and on the 3 rd,5 th,7 th,9 th,11 th,13 th and 15 th day.Gene expression profiles was determined by Rat Gene 2.0 Array technology.ResultsSBP of blank control group rats stayed normal along the modeling cycle.At the 3rd day,SPB of model control group elevated to 120 mmHg(P<0.01),and continuously rose to 139 mmHg,along with changes like irritation,squealing,yellow urination and bloodshot eyes,which indicates the success of modeling.SBP of TRNM group was significantly lower (P<0.01) than model control group since the 5 th day.Microarray analysis showed that compared with model control group,106 genes were upregulated and 92 genes were downregulated in TRNM group.The expression of CYP1A1 and IGFBP-1,which have a close relationship with hypertension and organ damage,was significantly changed by Twirling-reducing needling.ConclusionTwirling-reducing needling manipulation at Taichong and Quchi can significantly lower the SBP of stress﹣induced pre-hypertension rats and effect its gene expression in kidney.

Keywords：acupuncture;twirling-reducing needling manipulation;stress-induced pre-hypertension;gene chip

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.007

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金“基于系統(tǒng)生物學(xué)的針刺對(duì)應(yīng)激性前期高血壓的調(diào)控機(jī)制與干預(yù)靶點(diǎn)的研究”(81373727)。

作者簡(jiǎn)介：紀(jì)智(1990-)，男，碩士研究生，主要從事針灸臨床及機(jī)理研究。

*通信作者：劉清國(guó)，男，教授，電話-13691517881，電子信箱-liuqingguo999@vip.sina.cn

中圖分類號(hào)：R245.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2016)03-0458-04

(收稿日期:2015-11-19)