麻杏二三湯對哮喘大鼠肺組織TGF-β1和ET-1表達的影響

張 蕾 包天佑

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧，810001)

眾所周知哮喘是一種反復(fù)發(fā)作的常見病，而氣道重塑既是氣道炎癥反復(fù)刺激的結(jié)果［1］，又是哮喘向著不可逆發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。地塞米松作為治療哮喘炎癥有效制劑，在延緩氣道重塑方面也有一定作用［2］，但由于長期應(yīng)用可以造成患者對此藥敏感度降低以及服用西藥本身的不良反應(yīng)，故研制中藥治療哮喘迫在眉睫。麻杏二三湯作為焦樹德大師的代表方劑在臨床上治療慢性哮喘急性發(fā)作有明顯的作用［3］，本課題即是通過具體實驗數(shù)據(jù)來探索麻杏二三湯對哮喘氣道重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 將50只健康SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20)g(甘肅中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號:62001000000019，許可證號:SCXK(甘)2011-0001)在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行隨機分組:空白組(A組)、模型組(B組)、麻杏二三湯組(C組)、地塞米松組(D組)，每組共10只。

1.2 藥物 麻杏二三湯(炙麻黃、杏仁、化橘紅、半夏、茯苓、炒蘇子、萊菔子、白芥子、訶子、甘草、枇杷葉、茉莉花茶，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)門診部)，使用前將一劑(總重100 g)文火煎煮后濃縮成1 g/mL。醋酸地塞米松片(天津d藥藥業(yè)股份有限公司)，研磨于水，濃度為1 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器 雞卵清蛋白(OVA)(美國Sigma公司分裝);氫氧化鋁干粉(天津化學(xué)試劑三廠，分析純);大鼠ELLSA轉(zhuǎn)換生長因子-β1試劑盒、大鼠ELLSA內(nèi)皮素-1試劑盒(北京科博信生物技術(shù)有限公司);透明不完全封閉染毒缸(直徑40 cm，高45 cm);ZH-E11超聲霧化器(江蘇江航醫(yī)療設(shè)備有限公司);RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。

1.4 模型制備及藥物干預(yù) 參照文獻［4-6］并加以改良，制作哮喘大鼠早期氣道重塑模型。除空白組外，實驗開始的第1天、第8天、第15天將配好的致敏液1 mL(含有OVA 10 mg，氫氧化鋁干粉200 mg)分多點注射于其余各組大鼠:大鼠雙側(cè)腹股溝、腹部、一側(cè)前足趾共4點皮下注射，每點0.2 mL，同時腹腔注射0.2 mL。第16天時將大鼠放入染毒缸內(nèi)，每次放5只，除A組外用生理鹽水霧化，其余各組用2%OVA霧化吸入，1次/d，每次30 min，連續(xù)激發(fā)20 d。各組霧化30 min前每只大鼠給予藥物灌胃干預(yù):A組生理鹽水20 mL/kg;B組生理鹽水20 mL/kg;C組麻杏二三湯15 mL/kg+生理鹽水5 mL/kg;D組地塞米松1 mL/kg+生理鹽水15 mL/kg。激發(fā)后第一天，模型組可見大鼠煩躁、咳嗽、打噴嚏或行動遲緩、等癥狀。并從模型組隨機抽取一只處死，迅速取下右支氣管肺組織浸泡于4%多聚甲醛固定72 h并做病理切片，光鏡下觀察到支氣管和肺泡壁有多種炎性細胞浸潤，即哮喘發(fā)作激發(fā)成功。其余全部各組于末次激發(fā)后全部處死，全肺取出稱重，左肺迅速置于液氮中備用，右肺浸泡于4%多聚甲醛固定72 h。

1.5 檢測各種指標(biāo)

1.5.1 建造早期哮喘氣道重塑模型成功指標(biāo) 1)動物行為改變:每次哮喘激發(fā)過程中，大鼠煩躁不安、頻繁咳嗽打噴嚏或行動遲緩、俯仰不動、二便失禁、仰背式呼吸甚則發(fā)紺。2)生理指標(biāo):大鼠體重顯著下降，肺系數(shù)明顯升高。3)病理學(xué)指標(biāo):將浸泡于甲醛的肺右葉脫水、包埋、切片，HE染色。并用NYD1000型圖像分析軟件截取完整的支氣管測定管腔的內(nèi)周長(Pbm)、支氣管壁總面積(Wat)、支氣管平滑肌面積(Wam)，并用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，即分別以支氣管厚度=Wat/Pbm和平滑肌厚度=Wam/Pbm來衡量氣道重塑程度。造模成功顯示與空白組比支氣管壁厚度和氣道平滑肌明顯增厚。

1.5.2 肺組織TGF-β1和ET-1的檢測 取同等重量的左肺組織加等滲鹽水勻漿、離心，取其上清液，采用ELLSA法測定TGF-β1、ET-1表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPASS17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠實驗前后體重和肺系數(shù)比較 實驗前各組大鼠體重?zé)o顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。實驗后各組大鼠體重均不同程度增長，但各組之間存在明顯統(tǒng)計學(xué)意義(模型組大鼠在哮喘發(fā)作過程中死亡2只，不排除灌胃操作不當(dāng)致死的可能性)，模型組大鼠體重大于空白組、肺系數(shù)小于空白組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);麻杏二三湯組體重大于地塞米松組、肺系數(shù)小于地塞米松組，并都有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 實驗前各組大鼠體重(g)

表2 實驗后各組大鼠體重(g)、肺系數(shù)(%)

2.2 病理組織學(xué)變化 各組大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度增厚，以模型組尤為顯著(P＜0.05);與模型組比，兩個用藥干預(yù)組大鼠的體重較大、肺系數(shù)較低、氣管壁厚度和平滑肌厚度明顯降低(P＜0.05)，且麻杏二三湯組支氣管壁和平滑肌厚度都低于地塞米松組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠病理學(xué)指標(biāo)(%)

2.3 肺組織TGF-β1和ET-1含量分析 與空白組比，模型組TGF-β1和ET-1含量較高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比，兩個藥物干預(yù)組 TGF-β1和ET-1含量均較低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。麻杏二三湯組TGF-β1和ET-1含量低于地塞米松組組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表4和圖1。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1和ET-1含量(ng/L)

圖1 各組大鼠肺組織TGF-β1和ET-1含量

3 討論

近年來關(guān)于哮喘的發(fā)病機制有很多學(xué)說，其中主要的有:氣道炎癥學(xué)說、神經(jīng)——受體失衡學(xué)說、免疫與變態(tài)反應(yīng)學(xué)說。哮喘的傳統(tǒng)治法是應(yīng)用激素類藥物對炎癥的治療，而近年多項研究和仍然高發(fā)的哮喘表明單純的抗炎無法徹底治療哮喘，并在哮喘患者的尸體解剖中發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌和氣道管壁的增厚是其明顯的病理特征［7-8］，即氣道重塑。另有研究表明氣道重塑不單出現(xiàn)在重度哮喘患者上，還可在輕度哮喘和哮喘的早期被發(fā)現(xiàn)［9］，可推測氣道重塑很可能是哮喘不易根治的重要病理基礎(chǔ)，而延緩甚至阻止氣道重塑也是治療哮喘的重要方向和難解之題。本課題利用延長OVA激發(fā)時間復(fù)制哮喘氣道重塑模型已得到廣泛的認可和應(yīng)用［10］，而基于哮喘發(fā)作時管腔內(nèi)周長和氣道管壁面積保持不變原理，分別將Wat和Wam用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，克服了大小不同、狀態(tài)不同和切片方向不同氣管造成的誤差，所得出的比值能客觀反映氣道重塑的程度，是判斷造模效果主要指標(biāo)。本實驗在連續(xù)激發(fā)哮喘20 d后，模型組支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度明顯大于空白組，有統(tǒng)計學(xué)意義，即早期哮喘氣道重塑造模成功。

TGF-β1是一類多效能的生長調(diào)節(jié)因子，在細胞的生長、分化、免疫調(diào)節(jié)及細胞外基質(zhì)合成調(diào)節(jié)中有重要作用［11-12］，在哮喘發(fā)作過程中主要由肺及氣道的嗜酸性粒細胞、成纖維細胞大量釋放，并表現(xiàn)在大鼠肺組織TGF-β1顯著升高，其下游信號 TGF-β1/Smads活化，同時被釋放的TGF-β1反之又刺激了氣道上平滑肌細胞和成纖維細胞使其細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積，構(gòu)成了氣道重塑的重要基礎(chǔ)。ET-1是機體在缺氧缺血應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種致?lián)p傷因子，它是已知最強烈的縮血管物質(zhì)和支氣管收縮劑，廣泛存在于血管內(nèi)皮細胞、氣管、支氣管黏膜、平滑肌、肺血管，在體內(nèi)肺部分布最多，并且哮喘發(fā)作時氣道上皮含量是最高的，可以通過直接收縮氣道平滑肌及刺激花生四烯酸、血小板活化因子、組胺等致使多種炎癥釋放，使氣道高反應(yīng)性增高，同時使其缺血、缺氧情況更加嚴重，因此ET-1常用于檢測檢測患者哮喘嚴重程度［13］。本實驗?zāi)Ｐ徒M的肺組織 TGF-β1、ET-1含量明顯升高，提示哮喘發(fā)作和氣道重塑過程中這兩個因子都有參與且成正相關(guān)。因而具有有效拮抗TGF-β1和ET-1的藥物是哮喘治療中重要的研究方向。

中醫(yī)認為哮喘發(fā)作是人體內(nèi)環(huán)境紊亂基礎(chǔ)上加上“非時之感”，即外感六淫或煙塵、毛屑、異味、飲食不當(dāng)?shù)?。本課題用方——麻杏二三湯是我國著名中醫(yī)專家焦樹德的經(jīng)驗方，該方由炙麻黃、杏仁、化橘紅、半夏、茯苓、炒蘇子、萊菔子、白芥子、訶子、甘草、枇杷葉、茉莉花茶組成。方中麻黃、杏仁歸肺經(jīng)，麻黃宣肺平喘，杏仁降氣止咳，一宣一降同為君藥;化橘紅、半夏和炒蘇子、萊菔子、白芥子(三子養(yǎng)親湯)同為臣藥，燥濕化痰、理氣消食;茯苓、訶子、茉莉花茶及甘草，健脾利水，補肺潤肺共成佐使。現(xiàn)代藥理研究表明:麻黃中的有效成分麻黃堿可以間接發(fā)揮擬腎上腺素的作用、興奮支氣管α-受體和β-受體來松弛氣管平滑肌，麻黃揮發(fā)油有明顯平喘抗炎祛痰作用，同時麻黃還能調(diào)節(jié)輔助性T細胞和抑制性T細胞的比例［14］;杏仁和枇杷葉中含有的杏仁苷可以在胃中產(chǎn)生胃微量氫氰酸，促進肺表面活性物質(zhì)生成，進而減少炎性滲出，同時對呼吸中樞有鎮(zhèn)靜作用以達到平喘效果［15-16］;半夏含有生物堿、有機酸等多種成分，其中總游離有機酸有明顯的鎮(zhèn)咳祛痰功效［17］;麻黃、杏仁、半夏三藥合用能夠降低哮喘患者白介素4、一氧化氮、免疫球蛋白E水平，從而抑制氣道炎癥和延緩氣道重塑［18］;炒蘇子、萊菔子、白芥子均可行痰化痰、降氣平喘，對非特異性炎癥的抑制作用較好［19］;茯苓和化橘紅提取物具有抗菌、抗炎、抗病毒作用［20］。諸藥合用，共奏化痰蠲飲、降氣平喘之功。

總結(jié)本次試驗結(jié)果:1)與實驗前相比，實驗后各組大鼠體重均有增長，但各組之間體重和肺系數(shù)仍存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義:兩個藥物干預(yù)組的大鼠體重較模型組體重數(shù)值升高、肺系數(shù)降低，且有意義;麻杏二三湯組的大鼠肺系數(shù)小于地塞米松組，且有意義。臟器系數(shù)可以客觀的表現(xiàn)藥物對該臟器的毒性作用［21］，因此該實驗提示地塞米松的應(yīng)用仍存在不良反應(yīng)，長期臨床用藥及哮喘緩解期可以單用麻杏二三湯。2)與模型組比較，兩個用藥干預(yù)組氣道管壁和平滑肌厚度、TGF-β1和ET-1含量都有降低，且有臨床意義，表明兩種用藥方法都對延緩氣道重塑方面有一定作用;麻杏二三湯組的氣道管壁和平滑肌厚度降低效果優(yōu)于地塞米松組。但在哮喘發(fā)作過程中麻杏二三湯如何降低TGF-β1、ET-1并同各種炎性遞質(zhì)相互作用進而延緩氣道重塑有待進一步探討。

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