扶正化積方劑對H22肝癌小鼠抑瘤的作用

李曉娟，白云峰，王睿林，鄔順全，侯 俊，李瑞生

（1.解放軍第302醫(yī)院實驗技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京 100039）

扶正化積方劑對H22肝癌小鼠抑瘤的作用

李曉娟1，白云峰2，王睿林2，鄔順全1，侯 俊1，李瑞生1

（1.解放軍第302醫(yī)院實驗技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京 100039）

目的研究扶正化積方（FZHJF）對小鼠H22肝癌移植瘤的抑制作用及對免疫功能的影響。方法建立小鼠皮下H22移植性肝癌模型，隨機分為模型對照組、FZHJF低、中、高劑量組（4.55、13.65、40.95g/kg）和5-氟尿嘧啶組（0.2mL/10g），連續(xù)給藥12d后，采集腫瘤與臟器稱重并計算抑瘤率、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；同時對各組腫瘤外觀和腫瘤病理進行分析。結(jié)果腫瘤病理結(jié)果顯示均為典型的肝細胞癌。FZHJF劑量組的瘤重顯著低于模型對照組（P＜0.05），F(xiàn)ZHJF的抑瘤率隨劑量升高而增加，高劑量組的抑瘤率（49.02％）接近5-FU組（51.51％）；腫瘤外觀圖顯示FZHJF從低劑量至高劑量組的腫瘤體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，且均小于模型對照組。FZHJF各劑量組的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均顯著高于模型對照組與5-FU組（P＜0.05）。結(jié)論FZHJF對H22肝癌移植瘤具有顯著的抑制作用和免疫增強作用，為今后臨床研究提供了試驗數(shù)據(jù)。

FZHJF；移植性肝腫瘤；抑瘤率；免疫功能

目前臨床上的原發(fā)性肝癌死亡率較高，位居各種惡性腫瘤的第三位［1］。由于其起病隱匿，發(fā)展迅速，預(yù)后差，因而對肝癌的防治研究以及降低其發(fā)病率和死亡率仍是目前面臨的一個重要課題［2-3］。迄今為止，肝癌仍以手術(shù)治療為首選，但部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期而不能手術(shù)，或手術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移造成預(yù)后不良，因此迫切需要探索尋找療效更好的治療藥物和其他方法［4］。我國是中醫(yī)藥大國，中醫(yī)藥在抑制腫瘤生長，提高患者生存質(zhì)量和延長患者生命等方面有著得天獨厚的優(yōu)勢，已逐漸成為各種疾病研究的熱點［5］。FZHJF（抗癌方）經(jīng)臨床觀察，對肝癌有明顯的抑制作用并能改善患者生存質(zhì)量和延長其生命。為探討該方藥的抗癌作用機制，本實驗通過建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，觀察FZHJF對小鼠H22肝癌移植瘤的生長抑制作用及其對免疫功能的影響，以期為該方劑的藥理機制研究和臨床應(yīng)用提供可靠的實驗數(shù)據(jù)打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與瘤株細胞

選擇SPF級昆明小鼠45只，雄性，20～22g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK（軍）2012-0004】。本實驗室具有SPF級實驗動物使用許可證【SYXK（軍）2012-0010】。H22肝癌細胞株來源于解放軍302醫(yī)院藥學(xué)部實驗室。

1.2 實驗藥物

注射用5-氟尿嘧啶（5-FU，0.25g/10mL）購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號FA131122；生理鹽水由解放軍第302醫(yī)院制劑室提供（石家莊四藥有限公司，批號：130527405）；抗癌方劑FZHJF顆粒是由黨參、炙黃芪、焦白術(shù)、茯苓、白芍、地龍肉、玄參、草河車、半枝蓮、紅花、生牡蠣、干姜、天花粉、夏枯草、當(dāng)歸、丹皮、雞內(nèi)金、山甲珠、炙甘草、白花蛇舌草配伍組成，由302醫(yī)院藥劑室配置，15g/袋。

1.3 模型制備及分組

將制備好的H22細胞懸液（癌細胞數(shù)調(diào)至1×108/mL）注射于小鼠右側(cè)腋窩下（0.2mL/只）［4］。接種24h后將小鼠隨機分為5組（9只/組）：模型對照組，F(xiàn)ZHJF顆粒低、中、高劑量（4.55、13.65、40.95g/kg）組、5-FU組。FZHJF的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式：小鼠劑量（g/kg）=9.1×人臨床劑量（0.5g/kg）。此劑量作為低劑量，中劑量與高劑量分別為低劑量的3倍和9倍。FZHJF各劑量組的灌胃容量為0.55mL/20g小鼠體重，模型對照組灌胃等容積的生理鹽水，5-FU組腹腔注射（0.2mL/10g），1次/d，連續(xù)12d。

1.4 檢測指標(biāo)

末次給藥后次日稱體重，處死小鼠剖取腫瘤稱重。根據(jù)公式計算抑瘤率=［1-（實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）］×100％；同時采集各組小鼠的肝臟、胸腺和脾臟分別稱重，計算各組小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)［6］。將各組剝離的腫瘤組織置入10％甲醛固定，HE染色觀察［4］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0分析軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析并進行組間兩兩比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對各組H22荷瘤小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量和腫瘤的影響

實驗前小鼠活動、飲食、毛色均無異常。實驗第5天各組小鼠腋下均可觸及腫瘤，5-FU組小鼠毛色較暗，易激惹。給藥前各組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），實驗結(jié)束時，與模型對照組比較，5-FU組的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；而FZHJF中、高劑量組的體質(zhì)量顯著高于5-FU組（P＜0.05）。與模型對照組比較，F(xiàn)ZHJF中、高劑量組和5-Fu組的瘤重顯著減輕（P＜0.05）；而FZHJF低劑量組的瘤重顯著高于5-FU組與高劑量組（P＜0.05）。FZHJF的抑瘤率隨劑量升高而增加，高劑量組抑瘤率接近于5-FU組（表1）。

表1 FZHJF對H22荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤重及抑瘤率的影響Tab.1 Effect of FZHJF on body weight，the tumor weight and inhibition rate of H22-bearing mice

2.2 藥物對各組H22荷瘤小鼠腫瘤大小作用的對比分析

各組荷瘤小鼠的腫瘤病理結(jié)果均證實為典型的肝細胞癌。各組小鼠的腫瘤外觀圖對比顯示：模型對照組腫瘤較大，F(xiàn)ZHJF從低劑量至高劑量組的腫瘤體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，且高劑量組腫瘤的大小與5-FU組腫瘤大小相仿（圖1）。

2.3 藥物對各組H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

實驗結(jié)束時，各劑量組肝臟指數(shù)之間均不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。而FZHJF各劑量組的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著高于模型對照組和5-FU組（P＜0.05）（表2）。

圖1 各組小鼠移植腫瘤外觀比較（標(biāo)尺=1cm）Fig.1 The appearance of liver tumors in each group（Bar=1cm）

表2 FZHJF對H22荷瘤小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Tab.2 Effect of FZHJF on liver index，spleen and thymus index of H22-bearing mice

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，原發(fā)性肝癌屬正氣不足，濕熱、痰濁、瘀血、氣滯等積聚所成。因此，采用扶正培本、活血化瘀、清熱解毒是中醫(yī)治療肝臟腫瘤的基本原則，而扶正抑瘤法是較高層次的治療大法，同時需要結(jié)合不同的治療方法靈活應(yīng)用［7］。邢風(fēng)舉［8］等報道周仲瑛教授以味少量輕的扶正藥物為基礎(chǔ)，味多量大的具有不同治療作用的抗腫瘤藥物為主導(dǎo)，佐以數(shù)味治療兼癥或新癥的藥物配伍治療肝癌，效果甚佳；何仁強［9］等應(yīng)用扶正化毒消癌方用于中晚期肝癌患者能改善肝功能、提高生存質(zhì)量并延長生存期；苑靜波等［10］以扶正健脾中藥聯(lián)合經(jīng)肝動脈插管灌注化療及栓塞治療肝癌，效果良好。上述研究均在使用“扶正”中藥的基礎(chǔ)上，加入不同功能的抗腫瘤中藥用于臨床肝癌的治療。而本方也同樣以扶正培本類中藥為基礎(chǔ)，加入活血化瘀類和清熱解毒類中藥（紅花、茯苓、半枝蓮等），同時配伍軟堅散結(jié)類藥物（牡蠣、夏枯草）以及治療兼癥藥物（白芍、地龍肉、玄參等），經(jīng)長期臨床觀察效果佳。然而目前國內(nèi)外有關(guān)此方治療原發(fā)性肝癌的基礎(chǔ)性研究鮮有報道。

本實驗通過建立肝癌H22移植瘤小鼠模型，觀察FZHJF（抗癌方）對肝癌移植腫瘤的抑制作用。腫瘤病理結(jié)果顯示均為典型的肝細胞癌，說明H22移植瘤模型成功。中藥治療結(jié)果顯示，F(xiàn)ZHJF劑量組的瘤重顯著低于模型對照組（P＜0.05），F(xiàn)ZHJF的抑瘤率隨劑量升高而增加，高劑量組的抑瘤率（49.02％）接近5-FU組（51.51％）。同時腫瘤外觀圖更加直觀地示FZHJF從低劑量至高劑量組的腫瘤體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。上述結(jié)果均說明此方對肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用。眾所周知，抗腫瘤治療必須依靠機體自身免疫功能的增強或者恢復(fù)，而胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的大小可直接反映機體免疫水平的高低［11］。本實驗結(jié)果顯示，模型對照組和5-FU組的荷瘤小鼠有脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低的現(xiàn)象，說明腫瘤以及化療藥物能導(dǎo)致機體的免疫水平下降。而FZHJF各劑量組均能夠使荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），說明FZHJF可促進胸腺和脾臟細胞的增殖分化，具有一定的免疫增強作用從而增強其抑制腫瘤的效果，此結(jié)果與部分中藥具有增強機體免疫功能作用結(jié)果相一致［12］。但此方中各味中藥各自發(fā)揮的抑癌作用需進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，F(xiàn)ZHJF對H22肝癌移植瘤具有顯著的抑制作用，其抑瘤作用與5-FU相近似，同時還可增強機體胸腺和脾臟細胞的增殖分化，具有免疫增強作用，為FZHJF（抗癌方）的臨床實踐提供了試驗數(shù)據(jù)。

［1］黃展，辛華，江旭東，等.獨角蓮醇提液對H22肝癌荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響［J］.腫瘤藥學(xué)，2013，3（6）：432-435.

［2］Forner A，Llovet JM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma［J］.Lancet，2012，379（9822）：1245-1255.

［3］CaoH，Phan H，Yang LX.Improved chemotherapy for hepatocellular carcinoma［J］.Anticancer Res，2012，32（4）：1379-1386.

［4］李曉娟，靳雪源，白冰珂，等.PLCε基因敲除小鼠移植性肝癌模型的建立與分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（4）：5-7.

［5］Qi F，Li A，Inagaki Y，et al.Chinese herbal medicines as adjuvant treatment during chemo-or radio-therapy for cancer［J］.Biosci Trends，2010，4（6）：297-307.

［6］李曉娟，張巧云，李蓓，等.BALB/c突變卷毛小鼠部分生長發(fā)育指標(biāo)初探［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（11）：36-39.

［7］胡陵靜，王懷碧，張國鐸.原發(fā)性肝癌的中醫(yī)治療現(xiàn)狀［J］.中國中醫(yī)急癥，2013，22（2）：273-275.

［8］邢風(fēng)舉，李柳，周仲瑛.周仲瑛教授應(yīng)用復(fù)法大方治療肝癌［J］.吉林中醫(yī)藥，2014，34（1）：22-25.

［9］何仁強，李配富，張寧，等.扶正化毒消癌方干預(yù)原發(fā)性肝癌中晚期患者36例［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（24）：296-300.

［10］苑靜波，蘇春芝，李光榮，等.扶正健脾中藥對介入治療后肝癌患者相關(guān)指標(biāo)影響觀察［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（10）：2027-2028.

［11］李曉晶，王愛潔.白花蛇舌草和半枝蓮微粉配伍對H22肝癌小鼠抑瘤作用的實驗研究［J］.江蘇中醫(yī)藥，2013，45（7）：66-68.

［12］蔡鵬，王建國，楊士勇，等.康艾注射液聯(lián)合化療治療晚期非小細胞肺癌的臨床研究［J］.中國腫瘤臨床與康復(fù)，2007，14（2）：142.

Experimental study of Fuzheng Huaji decoction inhibition effect on H22 tumor bearing mice

LI Xiao-juan1，BAI Yun-feng2，WANG Rui-lin2，WU Shun-quan1，HOU Jun1，LI Rui-sheng1
（1.Experimental Research Support Center，Beijing 100039，China；2.Liver Disease Center for Combined TCM and Western Medicine，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China）

ObjectiveTo study the anti-tumor and immune effects of FZHJF on H22 liver cancer-bearing mice.MethodsThe H22 transplanted mouse models were established and randomly divided into five groups：model group，low-，medium-and high-dose FZHJF（4.55，13.65，40.95g/kg）and 5-Fu groups（0.2mL/10g）.12 days after treatment，the tumor inhibitory rate，liver index，thymus index，spleen index were calculated.At the same time，the appearance of liver tumor and tumor pathology in different groups was analyzed.ResultsPathology results confirmed the tumors were hepatocelluar carcinoma.Tumor weight in FZHJF groups were lower than those of the model group（P＜0.05）；the tumor inhibitory rate increased with the dosage，and the tumor inhibitory rate in high dose group（49.02％）closed to 5-Fu group（51.51％）；the results of tumor appearance showed that the tumor volume have the trend of reduce gradually，and is smaller than the control group.Thymus index and spleen index in FZHJF groups were markedly higher than those of the model and5-FU groups（P＜0.05）.ConclusionFZHJF has significant anti-tumor effect on transplanted H22 tumor in mice and has the function of immunological enhancement，and these results will provide theoretical foundation for clinical practice of FZHJF.

FZHJF；Transplanted liver cancer；The tumor inhibitory rate；Immune function

R-332

A

1671-7856（2015）11-0042-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.010

解放軍第302醫(yī)院院長創(chuàng)新基金（YNKT2013026）。

李曉娟（1980-），女，碩士，E-mail：sxlily55@163.com；白云峰（1970-），男，博士；李曉娟和白云峰為并列第一作者。

李瑞生（1969-），男，博士，副研究員，主要從事人類疾病動物模型研究，E-mail：lrsheng@sohu.com；侯俊（1973-），女，博士，副主任技師，E-mail：houjun5757@sina.com。

﹞2015-10-10