外源NO對(duì)鎘脅迫下蓖麻亞細(xì)胞中鎘分布及抗氧化酶的影響

張晗芝

摘 要：重金屬的亞細(xì)胞分布及抗氧化酶系統(tǒng)是植物解毒的重要策略。一氧化氮（NO）是植物組織內(nèi)重要的信號(hào)分子，在植物響應(yīng)各種逆境條件發(fā)揮重要作用。該研究采用水培試驗(yàn)，研究外源NO（SNP）對(duì)5 mg·kg-1 Cd脅迫下蓖麻中鎘的亞細(xì)胞分布及抗氧化酶活性的影響，探討NO調(diào)節(jié)下蓖麻對(duì)鎘的解毒機(jī)制。研究表明，與鎘處理下相比，100 μmol·L-1 SNP提高了金屬解毒組分，降低了金屬敏感組分；提高了過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，不能明顯影響超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）的活性變化。因此，NO通過(guò)提高金屬解毒組分的含量和CAT活性，參與蓖麻對(duì)鎘的解毒作用。

關(guān)鍵詞：鎘 蓖麻 亞細(xì)胞 抗氧化酶 一氧化氮

中圖分類號(hào)：X173 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2015）12（a）-0157-03

重金屬在植物亞細(xì)胞的分布能夠反映植物的解毒機(jī)理（Wang和Rainbow，2006；Miao和Wang，2007）。采用差速離心法，組織細(xì)胞可分為5種亞細(xì)胞組分：金屬富集顆粒體、細(xì)胞碎屑、細(xì)胞器、熱敏感蛋白和熱穩(wěn)定蛋白（Wallace等，2003）。重金屬脅迫下海洋硅藻、無(wú)脊椎動(dòng)物和小麥等生物體的亞細(xì)胞區(qū)隔化已經(jīng)開(kāi)展過(guò)研究（Miao和Wang，2006；Wallace等，2003；Li等，2011）。

另外，抗氧化酶系統(tǒng)是植物抵抗鎘脅迫的一種解毒策略。鎘脅迫能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)細(xì)胞的氧化脅迫，導(dǎo)致活性氧種類的增加，損害細(xì)胞組分（Sandalio等，2001）。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）等抗氧化酶在清除活性氧方面發(fā)揮重要的作用，有效抵抗了重金屬毒性導(dǎo)致的氧化脅迫（Vanassche和Clijsters，1990；Chaoui等，1997）。而且，抗氧化酶活性水平能夠反映生物化學(xué)過(guò)程并預(yù)示金屬毒性（Li等，2011）。

蓖麻（Ricinus communis L.）是一種重要的能源作物，而且是潛在修復(fù)鎘污染農(nóng)田的理想作物（Agarwal，2007；Huang，2011）。研究NO調(diào)節(jié)下蓖麻對(duì)鎘的解毒機(jī)制非常有意義。一氧化氮（NO）是植物體內(nèi)一種生物活性分子，通過(guò)酶促和非酶促途徑產(chǎn)生，能緩解各種環(huán)境毒害（王芳等，2013）。

目前，關(guān)于外源NO（硝普鈉作為供體）對(duì)鎘脅迫下蓖麻中鎘的亞細(xì)胞分布及抗氧化酶活性影響研究還很少。本研究的目的：（1）探討外源NO影響下蓖麻中鎘的亞細(xì)胞分布特征；（2）研究外源NO影響下蓖麻抗氧化酶活性的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)為水培試驗(yàn)，在溫室進(jìn)行。溫室設(shè)定的溫度為晝夜25/15 ℃，光強(qiáng)度為300 mE/m2/s，16 h的光周期，平均相對(duì)濕度為65%。試驗(yàn)采用50%霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，組分包含2.5 mmol·L-1 KNO3，2.5 mmol·L-1 Ca（NO3）2，0.5 mmol·L-1 MgSO4，0.5 mmol·L-1 KH2PO4，25 μmol·L-1 H3BO3，2.25 μmol·L-1 MnCl2，0.15 μmol·L-1 CuSO4，1.9 μmol·L-1 ZnSO4，0.05 mmol·L-1（NH4）6Mo7O24和5 μmol·L-1 Fe-EDTA。選用的蓖麻品種Zibo-3由山東省淄博市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。蓖麻種子開(kāi)始播種在無(wú)污染的人工土壤上生長(zhǎng)2～3周，直到種苗具有兩片健壯的葉子。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的蓖麻幼苗種植與含有400 mL營(yíng)養(yǎng)液的1 L盆中。硝普鈉（SNP）的水溶液作為NO的供體，CdCl2 2.5 H2O的水溶液作為鎘污染來(lái)源。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，分別為對(duì)照（CK）、5 mg·kg-1 Cd（Cd）、5 mg·kg-1 Cd+100 μmol·L-1 SNP（Cd+SNP），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，蓖麻葉用于測(cè)定生理指標(biāo)。營(yíng)養(yǎng)液每三天更換一次，營(yíng)養(yǎng)液的pH值保持在6.0±0.1。蓖麻幼苗在水培溶液中生長(zhǎng)10天。

收獲的植物鮮葉先用自來(lái)水清洗，然后用超純水清洗3 遍，最后用吸水紙擦拭，保證無(wú)水分殘留。新鮮葉保存在液氮中，分析抗氧化酶、可溶性蛋白和亞細(xì)胞分布。

1.2 蓖麻葉中鎘的亞細(xì)胞分布

根據(jù)差速離心法（Zhang等，2015），細(xì)胞內(nèi)的鎘可分離為5個(gè)亞細(xì)胞組分：金屬富集顆粒體、細(xì)胞碎屑、細(xì)胞器、熱敏感蛋白和熱穩(wěn)定蛋白。5個(gè)亞細(xì)胞組分的鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)用火焰原子吸收光譜測(cè)定（Contra AA 700，Germany）。細(xì)胞器和熱敏感蛋白組分定義為金屬敏感組分，金屬富集顆粒體和熱穩(wěn)定蛋白定義為生物解毒組分（Wang和Rainbow，2006）。數(shù)據(jù)為三個(gè)重復(fù)的平均值。

1.3 抗氧化酶和可溶性蛋白測(cè)定

新鮮的葉子（0.2 g）經(jīng)過(guò)預(yù)冷的研磨器研磨達(dá)到均質(zhì)化，由緩沖液提取。緩沖液的組分為：0.05 mmol·L-1的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶解于1%聚乙烯吡咯烷酮，調(diào)節(jié) pH值為7.4。均勻的溶漿在10 000 g4 ℃的離心機(jī)中離心10 min（Li等，2011）。上清液用于可溶性蛋白和抗氧化酶活性的測(cè)定。蓖麻葉中可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)的方法?？扇苄缘鞍椎暮勘硎緸閙g protein·g -1。氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活性（Giannopolitis等，1977）。SOD活性以抑制NBT光還原反應(yīng)50%所需的酶量為一個(gè)酶活性單位，表示為U/mg protein。過(guò)氧化氫酶（CAT）依據(jù)A240的變化速率計(jì)算CAT活性（Aebi，1984），以1 min內(nèi)A240降低0.1為一個(gè)酶活性單位（U），表示為U/mg protein。過(guò)氧化物酶（POD）依據(jù)A470的變化速率計(jì)算POD活性（Chance等，1955），以1 min內(nèi)A470降低1為一個(gè)酶活性單位（U），表示為U/mg protein。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）的方差分析和T檢驗(yàn)方法。所用指標(biāo)采用三個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)表示為平均值±誤差，用Duncans檢驗(yàn)顯著性差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻不同組織中鎘的亞細(xì)胞分布

以前研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol·L-1 SNP+5 mg·kg-1Cd處理的生物量相比5 mg·kg-1鎘脅迫顯著增加，但明顯低于對(duì)照處理的生物量。另外，相對(duì)于鎘處理，添加100 μmol·L-1 SNP提高了蓖麻根部和地上部分鎘的富集能力。亞細(xì)胞中鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相對(duì)含量（見(jiàn)表1）所示。相對(duì)于鎘處理，添加SNP處理細(xì)胞器和熱敏感蛋白中鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別顯著降低了65.6%和52.8%。添加SNP增加了生物解毒組分中鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)含量，降低了金屬敏感組分中鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)含量。

2.2 抗氧化酶活性

抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的活性（見(jiàn)表2）所示。相對(duì)于對(duì)照處理，5 mg·kg-1鎘處理?xiàng)l件下，SOD、CAT和POD的活性顯著降低；添加外源SNP后，CAT活性與Cd處理相比顯著提高，基本能恢復(fù)到對(duì)照水平，而SOD和CAT活性與Cd處理相比沒(méi)顯著差異。因此，添加SNP能通過(guò)調(diào)節(jié)CAT活性的方式緩解Cd脅迫下蓖麻葉中的氧化脅迫。

3 討論

生物體內(nèi)金屬的亞細(xì)胞分布反應(yīng)了金屬富集的內(nèi)在過(guò)程，是一種能夠預(yù)測(cè)金屬毒性和耐性的方法（Wallace等，2003）。Wang和Wang（2008）研究認(rèn)為金屬敏感組分能預(yù)測(cè)硅藻中鎘的毒性。Zhang等（2015）研究表明，蓖麻老葉中金屬解毒組分或者金屬敏感組分和蓖麻對(duì)鎘的耐性相關(guān)聯(lián)。該研究中SNP提高蓖麻對(duì)鎘耐性，可能與葉中金屬解毒組分增加和金屬敏感組分減少有關(guān)。

抗氧化酶（SOD、CAT和POD）是植物解毒機(jī)理的重要組成部分。SOD是一種金屬酶類，能夠催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和氧氣，保護(hù)細(xì)胞組分免受超氧自由基的毒害（Del Rio等，2002）。CAT和POD是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫含量的關(guān)鍵酶類（Blokhina等，2003）。研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下植物組織內(nèi)抗氧化酶活性增加（Yu等，2013）。然而，該研究發(fā)現(xiàn)，5 mg·kg-1鎘脅迫下蓖麻葉中SOD、CAT和 POD活性顯著降低（Table 2）。Zhang等（2015）研究也發(fā)現(xiàn)，5 mg·kg-1或2 mg·kg-1鎘脅迫下蓖麻葉中SOD、CAT和POD活性降低或無(wú)明顯變化，與該研究結(jié)果相符。外源NO（SNP）能夠提高抗氧化酶（SOD、CAT和POD）活性，增強(qiáng)植物對(duì)鎘的毒害（王芳等，2013）。然而一些研究發(fā)現(xiàn)，SNP降低了SOD和POD的活性（朱涵毅等，2013），與該研究結(jié)果一致。該研究中SNP提高了蓖麻葉中CAT活性，參與蓖麻對(duì)鎘的解毒作用。因此，該研究發(fā)現(xiàn)，NO通過(guò)提高金屬解毒組分的含量和CAT活性，參與蓖麻對(duì)鎘的解毒作用。

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