響應(yīng)面優(yōu)化牛蒡子多糖的提取及其抗氧化活性研究*

喻俊，王濤，賈春紅，孫繼業(yè)，胡尚欽，張利

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川雅安，625014)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安，625014)3(四川輔正藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都，611730)4(四川省農(nóng)科院中藥材研究中心，四川簡陽，641400)

牛蒡子(Fructus arctii)為菊科(Asteraceae)植物牛蒡(Arctium lappa L.)的果實。始載于《本草圖經(jīng)》，其味辛苦、性寒、歸肺胃二經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、祛痰止咳、解毒透疹、利咽消腫等功效［1］。牛蒡子的功效成分主要有多糖類、木質(zhì)素類、生物堿、揮發(fā)油和脂肪酸等［2］。牛蒡子具有抗腫瘤［3］、抗炎、抗糖尿病［4］、抗流感病毒和治療腦缺血［5］等作用。目前國內(nèi)外對牛蒡子的研究主要集中于木質(zhì)素類和多酚類等化學(xué)成分的鑒定及藥理功能上［6－7］，有關(guān)牛蒡子多糖(polysaccharides from fructus arctii，簡稱FAP)的研究較少，關(guān)于青蒿、紅花等菊科植物多糖研究較多，研究發(fā)現(xiàn)多種菊科類植物具有抑制癌癥［8］、調(diào)節(jié)免疫［9］、抗氧化［10］等作用。本研究采用超聲波輔助熱水法提取牛蒡子多糖，響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化提取工藝，對牛蒡子多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

牛蒡子，采自四川簡陽牛蒡種植基地;葡萄糖(AR)、苯酚(AR)、濃 H2SO4(AR)、95% 乙醇(AR)，成都市科龍化工試劑廠;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、四唑氮藍(lán)(NBT)、還原型輔酶 I鈉鹽(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)，美國Sigma;所用水均為超純水。

CP-114電子天平，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;SB-600DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;LGJ-12冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司;UV-1600PG紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司;GL-22MS高速冷凍離心機(jī)，匡貝實業(yè)有限公司;SA-205傅里葉交換光譜分析儀，Thorlabs公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素試驗

取體積分?jǐn)?shù)80%乙醇脫脂后干燥粉末10 g置于圓底燒瓶中，加水混合均勻后400 W超聲25 min，之后水浴加熱提取牛蒡子多糖。以牛蒡子多糖提取率為指標(biāo)，分別對液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g)、提取時間(1、2、3、4、5 h)、提取溫度(60、70、80、90、100℃)對提取率的影響進(jìn)行了研究和分析，確定各因素提取的最佳條件。

1.2.2 多糖含量和提取率測定

提取溶液中多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法［11］。取0.1 mL的提取液于試管中，加水至2.00 mL，加入6%苯酚溶液1.00 mL，搖勻，迅速加入濃H2SO45.00 mL，搖勻放置20 min。在490 nm波長處測定吸光度。根據(jù)多糖濃度與吸光度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=6.942x+0.029 9(R2=0.994)，計算可溶性多糖的含量。

1.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken design對超聲波輔助熱水提取進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以固液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為自變量，以牛蒡子多糖提取率為響應(yīng)值，確定3因素3水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗設(shè)計中的水平及編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 牛蒡子多糖的紅外光譜測定

取最優(yōu)條件提取的牛蒡子多糖2 mg與100 mg KI在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片機(jī)壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀中在4 000～450 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，觀察記錄譜峰［12］。

1.5 牛蒡子多糖的抗氧化活性研究

1.5.1 對DPPH·的清除作用

采用DPPH氧化法，用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液，參考聶少平［13］等人的方法測定牛蒡子多糖對DPPH·的清除能力，以Vc做陽性對照。每個樣品重復(fù)3次，求平均值。計算公式如下:

式中:Ao表示水代替樣品溶液的DPPH溶液的吸光度;Ai表示樣品溶液與DPPH混合溶液的吸光度;Aj表示不加DPPH溶液的樣品溶液的吸光度。

1.5.2 對羥基自由基(·OH)的清除作用

用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液，參考吳蘭芳［14］等人采用水楊酸法測定牛蒡子多糖·OH的清除能力，以Vc做陽性對照。每個樣品重復(fù)3次，求平均值。計算公式如下:

式中:Ao表示水代替樣品溶液的混合反應(yīng)溶液的吸光度;Ai表示樣品溶液與混合反應(yīng)溶液的吸光度;Aj表示不加水楊酸混合反應(yīng)溶液的吸光度。

1.5.3 對超氧陰離子(O2－·)的清除作用

用NBT顯色法測定，PMS/NADH體系會產(chǎn)生超氧自由基。用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液，參考宋坤［15］等人采用 NBT顯色法測定牛蒡子多糖對O2－·的清除能力，以Vc做陽性對照。每個樣品重復(fù)3次，求平均值。計算公式如下:

式中:Ao表示水代替樣品溶液的混合反應(yīng)溶液的吸光度;Ai表示樣品溶液與混合反應(yīng)溶液的吸光度。

1.5.4 還原力的測定

用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液。參考WANG［16］等人采用鐵離子總還原力測定方法測定牛蒡子多糖的還原能力，以Vc作為陽性對照。每個樣品重復(fù)3次，求平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013和Origin 8.0分析軟件對單因素試驗中的各因素進(jìn)行比較分析，采用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計和分析。所有試驗均重復(fù)3次，以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液固比對牛蒡子多糖提取率的影響

液固比是影響多糖提取率因素之一，不同液固比對牛蒡子多糖提取率的影響如圖1。

圖1 固液比Fig.1 Effect of ratio of water to raw material

由圖1可以看出，隨著液固比的增大，牛蒡子多糖的提取率先隨著液固比的增大而增大，當(dāng)液固比達(dá)到20∶1以后，牛蒡子多糖的提取率隨著液固比的增加基本不變。選擇最佳液固比20∶1(mL∶g)。

2.1.2 提取時間對牛蒡子多糖提取率的影響

如圖2所示，在1～3 h內(nèi)多糖的提取率隨時間的增加而增加，3 h時多糖的提取率為最大值5.87%。隨后增長提取時間，多糖的提取率基本趨于不變。這可能是由于時間的延長，牛蒡子多糖不斷被溶出，使得提取率上升，但提取時間過3 h以后，多糖已基本溶出，多糖提取率隨著提取時間的增加基本不變。選擇提取時間3 h為宜。

圖2 提取時間對牛蒡子多糖提取率的影響Fig.2 Eeffect of extraction time on the yield of FAP

2.1.3 提取溫度對牛蒡子多糖提取率的影響

從圖3可以看出，隨著提取溫度的上升，牛蒡子多糖的提取率先增加后減少，當(dāng)提取溫度為80℃時，多糖的提取率最高，當(dāng)溫度繼續(xù)升高多糖的提取率緩慢減少，溫度的升高可提高牛蒡子多糖的溶解度和多糖從組織中的滲出速率。但溫度過高則可能導(dǎo)致多糖分解，從而影響牛蒡子多糖的滲出。提取溫度選擇80℃為宜。

圖3 提取溫度對牛蒡子多糖提取率的影響Fig.3 Eeffect of extraction temperature on the yield of FAP

2.2 提取條件的優(yōu)

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，綜合分析單因素，選取對牛蒡子多糖提取率有影響的固液比、提取時間、提取溫度3因素，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。

使用Design Expert 8.0軟件，以固液比、提取時間、提取溫度為響應(yīng)變量，以牛蒡子多糖提取率為響應(yīng)面值對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進(jìn)行非線性回歸的二項式擬合，得到預(yù)測模型如下:

多糖提取率(Y)/%=6.32+0.28A+0.17B+0.54C+0.055AB－0.18AC－0.12BC－0.56A2－0.44B2－0.64C2

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

表3為回歸分析結(jié)果，該回歸模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬項(P＞0.05)不顯著，決定系數(shù)R2=0.983 8，=0.963 1，說明該模型與實際擬合較好，誤差較小，自變量與響應(yīng)面值之間線性關(guān)系顯著，可以用于牛蒡子多糖提取工藝試驗的預(yù)測。各因素的影響程度分析，由回歸系數(shù)檢驗值F值可以反映出各因素對試驗指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明該因素影響多糖提取率越大。FA=35.20，F(xiàn)B=12.30，F(xiàn)C=129.75，即各因素對提取率的影響程度大小順序為:提取溫度＞液固比＞提取時間。該模式的變異系CV=2.4%，在可接受范圍之內(nèi)［17－18］。

表3 回歸方程模型顯著性分析表Table 3 Significance testfor cofficients of the regression model developed

2.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面分析圖和等高線圖。如圖4所示。等高線的形狀可以反映出2個因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形與圓形可以表示交互作用的顯著與不顯著。由圖4可知，固液比與提取時間交互作用不顯著，固液比與提取溫度的交互作用較顯著，提取時間與提取溫度交互作用也較顯著。在本實驗中，提取溫度是影響牛蒡子多糖提取率的最重要的因素，次之為固液比，提取時間影響最小。

圖4 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots

2.2.3 提取工藝條件的驗證

通過得出的模型，超聲波輔助熱水提取牛蒡子多糖的最優(yōu)條件為:液固比為19.8∶1(mL∶g)，提取時間為3.1 h，提取溫度為85.1℃，提取率為6.43%。為了驗證模型的有效性，按最佳提取條件提取，試驗重復(fù)3次驗證，平均得率為6.40%，與理論值偏差小于0.33%。說明通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化后得到的最優(yōu)條件參數(shù)可靠，能較好的預(yù)測實驗得率。

2.3 牛蒡子多糖的紅外光譜分析

光譜是研究多糖官能團(tuán)的有效手段，通過對特征峰的分析，可以初步判斷多糖的官能團(tuán)。牛蒡子多糖的紅外光譜圖如圖5所示。3 400－1波數(shù)處為多糖的-OH的伸縮振動峰，2 900-1波數(shù)處為C-H的伸縮振動峰，在1 600－1波數(shù)為 C ═ O 的伸縮振動［19］，在 950－1 200－1波數(shù)處的吸收峰為 C—O—H和C—O—C的變角振動［20］，在 600～800－1有吸收，表明該多糖由-吡喃糖苷鍵連接［21］。由此可知，牛蒡子多糖具有典型的多糖特征吸收峰［22］。

圖5 牛蒡子多糖的紅外光譜圖Fig.5 The IR spectra ofFAP

2.4 牛蒡子多糖的體外抗氧化活性評價

(1)DPPH自由基的清除作用。牛蒡子多糖和Vc對DPPH·的清除作用如圖6(a)所示。由圖6-(a)可知，牛蒡子多糖對DPPH·具有一定的清除作用。在濃度0.2～2 mg/mL內(nèi)，牛蒡子多糖和Vc對DPPH·的清除能力隨濃度的增大而增大，牛蒡子多糖對DPPH·的清除能力由15.2%增至80.8%，具有量效關(guān)系，計算出牛蒡子多糖對DPPH·的IC50值為1.05 mg/mL。

(2)對·OH的清除作用。牛蒡子多糖和Vc對·OH的清除作用如圖6(b)所示。由圖6-(b)可知，在濃度0.2～2 mg/mL內(nèi)，牛蒡子多糖和Vc對·OH自由基的清除能力隨濃度的增大而增大，牛蒡子多糖對·OH自由基的清除能力隨著濃度的增大由11.34%增至70.69%。計算出牛蒡子多糖對·OH自由基的IC50值為1.21 mg/mL。

(3)對O2－·的清除作用。牛蒡子多糖和Vc對·的清除作用如圖6(c)所示。由圖6(c)可知，在濃度0.2～2 mg/mL內(nèi)，牛蒡子多糖和Vc對·自由基的清除能力隨濃度的增大而增大。在濃度0.2～2 mg/mL范圍內(nèi)，牛蒡子多糖對O2－·陰離子的清除能力隨著濃度的增大由10.8%增至68.3%。計算出牛蒡子多糖對O2－·陰離子的IC50值為1.25 mg/mL。

2.4.4 還原力測定

抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在一定的關(guān)系，抗氧化劑是通過自身的還原作用給出2個電子而清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。因此，可通過測定還原力來說明其抗氧化性的大小。牛蒡子多糖和Vc的還原力如圖7所示。牛蒡子多糖和Vc的還原能力隨濃度的增大而增大，在濃度0.2～2 mg/mL內(nèi)，牛蒡子多糖的還原能力隨著濃度的增大由12.2%增至58.3%，還原力表現(xiàn)出量效關(guān)系。根據(jù)計算，IC50值為1.43 mg/mL。

圖6 牛蒡子多糖和Vc對DPPH清除作用(a)，·OH清除作用 (b)，O2－·清除作用 (c)，F(xiàn)ig.6 Scavenging effect of FAP and Vc on DPPH radical(a)，on hydroxyl radical(b)，on superoxide anion free radical(c)

圖7 牛蒡子多糖和VC的還原能力Fig.7 Scavenging effect of FAP and Vc on reducing power

3 結(jié)論

本研究建立了超聲波輔助熱水法提取牛蒡子多糖的最佳工藝條件，即液固比19.8∶1(mL∶g)、提取時間3.1 h、提取溫度85.1℃，該最優(yōu)條件下牛蒡子多糖的提取率為6.43%，驗證值為6.40%，表明該模型合理可靠，能較好的預(yù)測超聲波輔助熱水法提取牛蒡子多糖的提取率。在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，牛蒡子多糖清除DPPH·、·OH、O2－·和還原力均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，清除DPPH·、·OH、和還原力的半數(shù)有效濃度(IC50)分別為1.05、1.21、1.25和1.43 mg/mL。牛蒡子多糖表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，可以作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用在食品和保健品工業(yè)中。

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