分光光度計比濁法測定抗菌物質效價*

王凱旋，衛(wèi)蘭蘭，洪婷，付瑞燕

(安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥，230036)

抗菌物質是指具有殺菌或抑菌活性的物質，包括細菌素、類細菌素和抗生素等生物活性物質。在過去的60多年里，多種能準確測定抗菌物質活性的方法先后被提出，包括ATP生物發(fā)光測定法(ATP Bioluminometry)、綠色熒光蛋白測定法(GFP bioassay)、MTT［3-(4，5-dimethyl thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide］比色法、免疫學方法等［1－4］，然而使用這些方法需要特殊的試劑或儀器設備，因此沒有得到廣泛應用。長期以來，瓊脂擴散法(agar diffusion assay)因無需特殊材料，檢測成本低［5－6］而成為測定抗菌物質活性最常用的方法，但是該法耗時耗力、對操作人員經驗要求高、人為影響因素多，實驗者經常得不到理想的實驗結果［7］。1952年，Berridge和Barrett首次應用微孔比濁法來測定抗生素效價［8］，經過幾十年的不斷改進，該法已以成為可以定量測定抗菌物質的一種方法［9－10］，但是，需要使用酶標儀這一“短板”限制了其廣泛應用，如能建立起分光光度計比濁法無疑將極大提高其應用普遍性。為此本研究對于影響分光光度計比濁法準確定量抗菌物質效價的關鍵因素進行了研究，建立了測定細菌素nisin、類細菌素NFL［11］和抗生素硫酸慶大霉素等抗菌物質效價的分光光度計比濁法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金黃桿菌(Chryseobacterium)NHW菌株、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NFL菌株和乳酸乳球菌(L.lactis)8148菌株，為安徽農業(yè)大學食品微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

STAA培養(yǎng)基:蛋白胨20 g，酵母抽提物2 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，甘油 15 g，瓊脂13 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.2，121℃下15 min滅菌后冷卻至40～50℃左右，加入過濾除菌的鏈霉素500 mg，環(huán)己六亞胺50 mg和乙酸鹽50 mg混勻，用于培養(yǎng)金黃桿菌NHW菌株。

MRS培養(yǎng)基:牛肉浸膏8.0 g，Tween-80 1.0 mL，葡萄糖20.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母抽提物4.0 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，醋酸鈉 5.0 g，Mn-SO4·H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0±0.2。用于培養(yǎng)乳酸乳球菌NFL菌株。

GM17培養(yǎng)基:補充了15 g/L葡萄糖的M17培養(yǎng)基(購自青島海博)，用于培養(yǎng)乳酸乳球菌8148菌株。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌物質抗菌類型的確定

乳酸乳球菌NFL發(fā)酵上清液的制備:將活化后的乳酸乳球菌NFL菌株以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，離心(10 000 r/min，15 min)取上清液，將上清液過濾除菌，取濾液備用。

硫酸慶大霉素、氯霉素和類細菌素NFL抗菌類型的確定:將活化后的指示菌金黃桿菌NHW菌株以5%接種量接種于STAA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數期，離心(10 000 r/min，5 min)取菌體，用生理鹽水洗滌1次，將菌體重懸于生理鹽水中，分別添加終質量濃度為16.67 μg/mL的氯霉素乙醇溶液、888.89 U/mL的硫酸慶大霉素水溶液、66.67 μL/mL的NFL菌上清液，30℃下振蕩 (150 r/min)培養(yǎng)6 h，分別在培養(yǎng)的0時刻和6 h取200 μL發(fā)酵液涂布于STAA平板表面，30℃下培養(yǎng)測定菌落總數。

nisin抗菌類型的確定:將活化后的指示菌乳酸乳球菌8148菌株以5%接種量接種于GM17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數期，離心(10 000 r/min，5 min)取菌體，用生理鹽水洗滌1次，將菌體重懸于生理鹽水中，添加終濃度為1.5 U/mL的nisin鹽酸溶液(0.02 mol/L)。30℃下靜置培養(yǎng)6 h，分別在培養(yǎng)的0 h和6 h取200 μL發(fā)酵液涂布于GM17平板表面，30℃下培養(yǎng)測定菌落總數。

1.2.2 不同抗菌物質抑菌率曲線的測定

將活化后的指示菌以2%的接種量接種于相應的培養(yǎng)基中，實驗組分別加入終質量濃度為16.67 μg/mL的氯霉素乙醇溶液(對照為無水乙醇)、888.89 U/mL的硫酸慶大霉素水溶液(對照為無菌水)、66.67 μL/mL的NFL菌株發(fā)酵上清液(對照為MRS培養(yǎng)基)和0.5 U/mL的nisin鹽酸溶液(對照為0.02 mol/L HCl溶液)，培養(yǎng)過程中每隔2 h取樣，立即轉入冰水浴中以終止微生物生長，于600 nm波長處測定吸光值(上海菁華，752紫外可見分光光度計)，連續(xù)測定至14 h。對照組加入量與實驗組體積相同，其余方法同實驗組。

抑菌率/%=(OD對照－OD實驗)/OD對照×100

1.2.3 抗菌物質效價分光光度計比濁法的建立

1.2.3.1 指示菌接種量對最佳取樣時間點的影響

乳酸乳球菌8148接種量對nisin效價測定取樣時間點的影響:將活化后的乳酸乳球菌8148菌株分別以2%、5%、8%的接種量接入GM17培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為0.5 U/mL的nisin鹽酸溶液，分別在30℃下靜置培養(yǎng)1、2、3 h，取樣，測定抑菌率和發(fā)酵液濁度增量，濁度增量OD600=OD600實驗－OD600起始。

金黃桿菌NHW接種量對類細菌素NFL效價測定取樣時間點的影響:將活化后的金黃桿菌NHW分別以1%、2%、3%的接種量接入STAA培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為66.67 μL/mL的NFL菌株發(fā)酵上清液，分別在30℃下振蕩培養(yǎng)3、4、5 h取樣，測定抑菌率和發(fā)酵液濁度增量OD600。

1.2.3.2 測定抗菌物質效價標準曲線的建立

nisin效價標準曲線的建立:將活化后的乳酸乳球菌8148菌株以5%的接種量接入GM17培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為 0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 U/mL的nisin鹽酸溶液，在30℃下靜置培養(yǎng)2 h，取樣測定抑菌率。另一實驗組中加入終濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 U/mL的nisin鹽酸溶液，在30℃下靜置培養(yǎng)5 h，取樣測定抑菌率。

2 h取樣的nisin效價標準曲線的驗證性實驗:將活化后的乳酸乳球菌8148菌株以5%的接種量接入GM17培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為0.4、1.0 U/mL的nisin鹽酸溶液，在30℃下靜置培養(yǎng)2 h，取樣測定抑菌率。根據標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測定誤差率(RSD)。

類細菌素NFL效價標準曲線的建立:將活化后的金黃桿菌NHW以2%的接種量接入STAA培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為 36.67、43.33、50.00、56.67、63.33 μL/mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，分別在30℃下振蕩培養(yǎng)4 h，取樣測定抑菌率。測定終濃度為40、60 μL/mL的NFL菌株發(fā)酵上清液的抑菌率，用所得標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測定誤差率(RSD)。

硫酸慶大霉素效價標準曲線的建立:將活化后的金黃桿菌NHW菌株以2%的接種量接入STAA培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度為444.44、533.33、622.22、711.10、799.99、888.88 U/mL 的硫酸慶大霉素水溶液，分別在30℃下振蕩培養(yǎng)4 h，取樣測定抑菌率。測定終濃度為577.77、755.55 U/mL的硫酸慶大霉素水溶液的抑菌率，用所得標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測定誤差率(RSD)。

2 結果與分析

2.1 不同抗菌物質的抑菌率曲線

從圖1可以看出，隨著指示菌在硫酸慶大霉素水溶液中處理時間的延長，細胞逐步被殺死，失去生長能力。而指示菌在nisin、氯霉素和NFL菌株發(fā)酵上清液中處理6 h，活菌數下降幅度均很小，nisin和氯霉素是已知的抑菌劑，表明NFL菌株發(fā)酵上清液具抑菌活性而非殺菌活性。

在指示菌培養(yǎng)基中分別添加以上各種抗菌劑后，測定其生長曲線，計算得到抑菌率曲線。從圖2可見，抑菌類抗菌劑nisin、氯霉素和NFL菌株發(fā)酵上清液的抑菌率曲線趨勢基本一致，都是先上升后下降，有一個明顯的峰值，也就意味著此時測定抑菌率，對于抗菌劑濃度的變化最為敏感。因此，將此時間點定為抑菌類抗菌劑最佳取樣時間點。而殺菌類抗菌劑硫酸慶大霉素的抑菌率曲線是快速上升至一個高點，穩(wěn)定一段時間后，再緩慢上升。

圖1 抗菌物質抗菌類型的確定Fig.1 Determination of antimicrobial types of antimicrobial substances

圖2 不同抗菌物質的抑菌率曲線Fig.2 The inhibitory rate curves of different antimicrobial substances

2 抗菌物質效價分光光度計比濁法的建立

2.1 接種量對最佳取樣時間點的影響

抑菌率計算的依據是生物量，而接種量的大小會直接影響微生物細胞生物量的高低，因此研究了指示菌接種量對最佳取樣時間點的影響。從圖3可以看出，中等(5%)和較高(8%)接種量下測定nisin濃度的最佳取樣時間點均為2 h。低接種量(2%)下，指示菌培養(yǎng)3 h的抑菌率高于2 h的，導致測定nisin濃度的最佳取樣時間點延后。最佳取樣時間點的確定不僅取決于最高抑菌率，還要兼顧指示菌生長增量和培養(yǎng)時間，如圖3所示，低接種量(2%)下指示菌培養(yǎng)3h的對照組(未添加 nisin)發(fā)酵液濁度增量(OD600)很低，表明此時體系中的活菌量較低，不能很好地表征nisin的抑菌效力，且培養(yǎng)時間偏長。因此，以乳酸乳球菌8148為指示菌來測定nisin濃度，最佳指示菌接種量為5%，最佳取樣時間點為2 h。

圖3 指示菌乳酸乳球菌8148接種量對測定nisin效價的取樣時間點的影響(虛線為濁度增量，實線為抑菌率)Fig.3 Influence of inoculum of indicator L.lactis 8148 on the sampling time point of nisin potency determination

由圖4可以看出，以金黃桿菌NHW為指示菌來測定類細菌素NFL的效價，同樣也表現出相同的趨勢，最佳指示菌接種量為2%，最佳取樣時間點為4 h。

圖4 指示菌金黃桿菌NHW接種量對測定類細菌素NFL效價的取樣時間點的影響(虛線為濁度增量，實線為抑菌率)Fig.4 Influence of inoculum of indicator Chryseobacterium NHW on the sampling time point of bacteriocin-like substance NFL potency determination

2.2 分光光度計比濁法測定抗菌物質效價的標準曲線的建立

2.2.1 測定nisin效價標準曲線的建立

以5%接種量接種指示菌乳酸乳球菌8148，在GM17培養(yǎng)基中添加不同終濃度的nisin，培養(yǎng)2 h，測定抑菌率，以抑菌率對nisin濃度值進行線性回歸。由圖5可知，在nisin終濃度為0.2～1.4 U/mL，抑菌率為25%～98%的范圍內，nisin濃度與抑菌率之間呈良好的線性關系(R2=0.9921)，驗證性實驗(表1)表明，該方法的準確度較高(RSD＜5%)。在非最佳取樣時間點測得標準曲線回歸方程的R2值低于0.99，表明此時取樣測定所得數據的線性相關度偏低;此外，此時回歸方程的斜率也低于最佳取樣時間點的，表明在非最佳取樣時間點下抑菌率對nisin濃度變化的敏感度偏低。

圖5 不同取樣時間點下nisin標準曲線的測定Fig.5 Determination of nisin standard curve under different sampling time points

表1 2 h取樣時的nisin標準曲線的驗證實驗Table 1 The verification experiment of 2 h-sampling nisin standard curve

2.2.2 測定類細菌素NFL效價標準曲線的建立

乳酸乳球菌NFL菌株發(fā)酵上清液中含有類細菌素NFL，與nisin不同，NFL菌株發(fā)酵上清液不是純品，其中還含有未被細胞利用完的營養(yǎng)物質及代謝產物，實驗發(fā)現，本比濁法同樣適用于發(fā)酵液中抑菌物質活性的定量測定。以2%接種量接種指示菌金黃桿菌NHW菌株，在STAA培養(yǎng)基中添加不同體積的NFL菌株發(fā)酵上清液，培養(yǎng)4 h，測定抑菌率，以抑菌率對NFL菌株發(fā)酵上清液添加量進行線性回歸。由圖6可知，在NFL菌株發(fā)酵上清液添加量為36～64 μL/mL，抑菌率為7% ～58%的范圍內，發(fā)酵上清液添加量與抑菌率之間的線性相關良好(R2=0.994)，驗證性實驗(表2)表明該方法的準確度較高(RSD＜5%)。

圖6 乳酸乳球菌NFL菌株發(fā)酵上清液標準曲線的測定Fig.6 Determination of standard curve of L.lactis NFL fermentation liquid supernatant

表2 乳酸乳球菌NFL菌株發(fā)酵液上清液標準曲線的驗證實驗Table 2 The verification experiment of supernatant of L.lactis NFL fermentation liquid standard curve

2.2.3 測定硫酸慶大霉素效價的標準曲線的建立

由圖7可知，nisin測定最佳取樣時間點(2 h)所對應的時刻是實驗組(培養(yǎng)基中含0.5 U/mL的nisin)生長曲線的對數前期。如前所述，硫酸慶大霉素的抑菌率曲線與nisin等抑菌劑的不同，并沒有呈現明顯的峰值，但在4 h時抑菌率會處于一直較高的平臺，此時對應的實驗組也基本處于對數前期(圖8)。

圖7 指示菌乳酸乳球菌8148生長曲線及nisin抑菌率曲線Fig.7 Indicator L.lactis 8148 growth curves and inhibitory rate curve of nisin

圖8 指示菌金黃桿菌NHW生長曲線及硫酸慶大霉素抑菌率曲線Fig.8 Indicator Chryseobacterium NHW growth curves and inhibitory rate curve of gentamicin sulfate

以2%接種量接種指示菌金黃桿菌NHW菌株，在STAA培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫酸慶大霉素，培養(yǎng)4 h，測定抑菌率，以抑菌率對硫酸慶大霉素濃度值進行線性回歸。由圖9可知，在硫酸慶大霉素終濃度為444～888 U/mL，抑菌率為30% ～64%的范圍內，硫酸慶大霉素濃度與抑菌率之間的線性相關良好(R2=0.9901)，驗證性實驗(表3)表明該方法的準確度較高(RSD＜5%)。實驗發(fā)現，如果以6 h(即對應的實驗組對數末期)為取樣時間點所取得的標準曲線回歸方程的R2值只有0.9673(圖9)，表明此時的硫酸慶大霉素濃度與抑菌率之間的線性關系較差。

圖9 不同取樣時間點下硫酸慶大霉素效價標準曲線的測定Fig.9 Determination of gentamicin sulfate standard curve under different sampling time points

表3 硫酸慶大霉素4h取樣標準曲線的驗證實驗Table 3 The verification experiment of 4 h-sampling gentamicin sulfate standard curve

3 討論

采用比濁法測定抗菌物質特別是抗生素效價的文獻不少，方法大致都是將抗菌物質加入指示菌培養(yǎng)體系中培養(yǎng)一段時間(一般為2～5h)測定濁度，抗菌物質濃度的對數與濁度在一定范圍內線性關系良好(R2＞ 0.99)［12－14］。但這些報道中均沒有說明抗菌物質與指示菌培養(yǎng)時間(即取樣測定濁度的時間點)的確切依據。李秀蘭等采用分光度度計比濁法測定抗菌肽活性，抗菌肽濃度與活力單位之間線性關系良好，但是操作較為復雜，需要將對數期的指示菌菌體洗滌后重懸于緩沖液中，加入抗菌肽樣品振蕩培養(yǎng)30 min后測定濁度，將所測結果代入經驗公式得到活力單位［15］。同樣，作者也沒有說明為何要培養(yǎng)30 min，這樣對于其他種類抗菌物質效價的測定，并不具有直接的借鑒意義。

本研究所建立的比濁法是將抑菌率與抗菌物質濃度之間直接建立線性相關，并且找到了抑菌劑和抗菌劑效價線性定量測定的關鍵因子，即取樣時間點。以nisin和硫酸慶大霉素的效價測定為例(圖5和圖9)，如果取樣時間點選擇得不好，所得的標準曲線R2值就會小于0.99，達不到線性相關的要求。無論是nisin這種抑菌劑還是硫酸慶大霉素這種殺菌劑，最佳取樣時間點對應的都是實驗組(即培養(yǎng)基中加入抗菌物質)生長曲線的對數前期(圖7和圖8)，這種規(guī)律性可能是因為本法采用的抑菌率指標依據的是對照組活細胞與實驗組中未被抑制或殺死的活細胞生長能力的比較，當取樣時間點為實驗組的對數前期，實驗組生物量基本可以反映當時的活細胞數;如果取樣時間點為實驗組的對數末期，實驗組生物量會包含部分死細胞，就會偏離效價與抑菌率之間的線性相關了。

除此之外，接種量的大小對抑菌率的高低有顯著的影響(圖3和圖4)，雖然低接種量下最高抑菌率值較高，但最佳取樣時間點會延后，且指示菌生長速度偏低，并不能很好地表現出抑菌物質的作用;高接種量從檢測時間和最高抑菌率方面均較差，因此，接種量的優(yōu)化對于提高本方法的應用效果十分必要。

本研究所建立的分光光度計比濁法不僅可用來準確測定nisin、類細菌素NFL和慶大霉素的效價，而且具有設備簡單、操作簡單等優(yōu)點。有理由相信，本方法也可以適用于其他抗菌物質效價的測定。首先，測定抗菌物質抑菌率曲線，以此為依據，抑菌劑以最高抑菌率對應的時間點為取樣時間點，殺菌劑可以結合實驗組生長曲線和抑菌率曲線，綜合考慮實驗組對數前期和抑菌率峰值選擇出合適的取樣時間點;隨后，測定指示菌不同接種量下的抑菌率，確定合適的指示菌接種量;最后，建立抑菌率與抗菌物質效價之間的標準曲線。

［1］ Daoudi L，Turcotte C，Lacroix C，et al.Production and characterization of anti-nisin Z monoclonal antibodies:suitability for distinguishing active from inactive forms through a competitive enzyme immunoassay［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56(1 － 2):114 －119.

［2］ Hakovirta J，Reunanen J，Saris PE.Bioassay for nisin in milk，processed cheese，salad dressings，canned tomatoes，and liquid egg products［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72(2):1 001 －1 005.

［3］ Valat C，Champiat D N，Guyen TT，et al.Use of ATP bioluminescence to determine the bacterial sensitivity threshold to a bacteriocin［J］.Luminescence，2003，18(5):254－258.

［4］ WANG F，CAO LT，HU SH.A rapid and accurate 3-(4，5-dimethyl thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide colorimetric assay for quantification of bacteriocins with nisin as an example［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2007，8(8):549－554.

［5］ Lalpuria M，Karwa V，Anantheswaran RC，et al.Modified agar diffusion bioassay for better quantification of Nisaplin［J］.Appl Microbiol，2013，114(3):663 －671.

［6］ Bonev B，Hooper J，Parisot J.Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method［J］.J Antimicrob Chemoth，2008，61:1 295 －1 301.

［7］ Papagianni M，Avramidis N，Filioussis G，et al.Determination of bacteriocin activity with bioassays carried out on solid and liquid substrates:assessing the factor"indicator microorganism"［J］.Microbial Cell Factories，2006，5:30－44.

［8］ Berridge NJ，Barrett J.A rapid method for the turbidometric assay of antibiotics［J］.J Gen Microbiol，1952，6:14－20.

［9］ 張恩戶，喬慧，王光建，等.微孔比濁法測定牛黃上清片的抗菌效價［J］.中藥藥理與臨床，2012，28(3):23－25.

［10］ WU Z，LI X.Modification of the data-processing method for the turbidimetric bioassay of nisin［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74(2):511 －516.

［11］ 倪萍，黃潔潔，紀文營，等.1株具廣譜抑菌活性的乳酸乳球菌的分離鑒定與保鮮效果［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(4):53 －57.

［12］ 張勝波，屈勝環(huán).微生物比濁法測定硫酸慶大霉素顆粒效價［J］.濟寧醫(yī)學院學報，2013，36(4):259－260.

［13］ 吳兆亮，賈永生，譚相偉，等.分光光度法快速測定乳鏈菌肽效價［J］.分析化學研究簡報，2006(34):227－230.

［14］ 應茵，樓娉婷.比濁法測定多西環(huán)素效價含量［J］.藥學實踐雜志，2013，31(5):368 －370.

［15］ 李秀蘭，戴祝英，張雙全.抗菌肽瓊脂糖孔穴擴散法與比濁法測定比較及其相關性［J］.南京師大學報(自然科學版)，1998，21(2):81 －83.