脊神經(jīng)后根切斷對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的影響

張 影，林 毅，顏 赫，張才新，時曉迪，金利新

(1．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，青島 266071;2．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，青島 266071）

脊神經(jīng)后根切斷對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的影響

張 影1，林 毅1，顏 赫1，張才新1，時曉迪1，金利新2

(1．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，青島 266071;2．青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，青島 266071）

目的觀察脊神經(jīng)后根切斷大鼠不同時期關(guān)節(jié)軟骨的變化特點及規(guī)律，進一步驗證部分感覺障礙可以引起關(guān)節(jié)軟骨損傷。方法 10周齡SPF級雄性Wistar大鼠33只隨機分為實驗組(18只）和對照組(15只）。切斷實驗組大鼠右側(cè)L3、L4脊神經(jīng)后根。對照組只切開皮膚及椎旁肌。觀察大鼠行為學(xué)改變。于術(shù)后2周、6周和10周三個時間點取右后肢股骨下端，制作組織石蠟切片。常規(guī)HE染色、番紅O/固綠染色觀察關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)改變及特點。結(jié)果 術(shù)后隨時間推移，實驗組大鼠右側(cè)后肢經(jīng)歷一過性癱瘓、協(xié)調(diào)運動障礙及主動運動的變化過程。右后肢股骨髕面逐漸變淺變寬。關(guān)節(jié)軟骨依次出現(xiàn)表面粗糙、細胞排列紊亂、細胞減少、潮線復(fù)制、漂移和中斷等變化。實驗組關(guān)節(jié)軟骨ACC/TAC值隨時間推移呈逐漸增大(t=5．25～8．13，P＜0．05）。結(jié)論脊神經(jīng)后根切斷可引起關(guān)節(jié)軟骨損傷及退行性改變。

脊神經(jīng)后根切斷;關(guān)節(jié)軟骨;軟骨損傷

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA）是一種以軟骨退行性變和累及整個關(guān)節(jié)的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，嚴重威脅人類的健康與生活質(zhì)量。研究顯示65歲以上人群中放射學(xué)OA的患病率可達50%以上，而在75歲以上人群中，這一數(shù)值可達到80%左右，但OA的病因及病理機制并不明確［1－3］，也缺乏有效的臨床治療方法與手段。有臨床研究顯示OA患者均存在不同程度的本體感覺誤差，而且對OA患者進行本體感覺康復(fù)訓(xùn)練，患者關(guān)節(jié)周圍的肌力、穩(wěn)定性、反應(yīng)速度等都有所提高，臨床癥狀得到緩解［4－5］。提示本體感覺障礙可能參與了OA的形成與發(fā)展。完整的反射弧是保證骨骼肌張力及關(guān)節(jié)穩(wěn)定的基本條件和前提。經(jīng)典骨關(guān)節(jié)炎動物模型是通過切斷關(guān)節(jié)韌帶、肌腱等效應(yīng)器裝置導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)而引起軟骨損傷?？梢酝茰y，切斷反射弧傳入神經(jīng)，同樣也可引起關(guān)節(jié)穩(wěn)定性改變和運動障礙，進而引起關(guān)節(jié)軟骨損傷，這可能是OA患者潛在的致病誘因。

本實驗旨在制作關(guān)節(jié)周圍感覺缺失動物模型，通過觀察實驗動物行為學(xué)變化及關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)學(xué)改變，探討感覺缺失可能引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷及變化特點，可為OA病因及發(fā)病機制提供新的模型和思路，為OA的預(yù)防治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物分組及造模

10周齡SPF級雄性Wistar大鼠，33只，體重268．2±23．5 g，來源于青島市實驗動物和動物實驗中心【SCXK(魯）2014－0001】，隨機分為實驗組(18只）和對照組(15只）。無菌手術(shù)在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心【SYXK(魯）2003－0008】進行。實驗組大鼠用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，行脊正中線偏右側(cè)切口，鈍性分離椎旁肌，從椎間孔入路切斷右側(cè)L3、L4脊神經(jīng)后根。生理鹽水沖洗手術(shù)視野，依次縫合消毒。對照組只切開椎旁肌，不損傷脊神經(jīng)。術(shù)后每天肌肉注射青霉素4萬U/只，連續(xù)注射3 d。正常飲食，自然光照。每天強制大鼠活動30 min，觀察記錄模型大鼠右后肢恢復(fù)情況，采用Tarlov評分標準進行運動功能評分。

1.2 標本采集與處理

術(shù)后2周、6周和10周3個時間點處死大鼠(實驗組6只，對照組5只），取右后肢股骨下端1 cm，置于4%多聚甲醛中固定24 h～48 h，15% EDTA－2Na微波脫鈣，石蠟包埋，切片。HE染色、番紅O/固綠染色，光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)改變，并參考改良的Mankin評分標準對關(guān)節(jié)軟骨進行評分，應(yīng)用Image Pro Plus6．0圖像分析軟件測量軟骨鈣化層、軟骨全層厚度，計算軟骨鈣化層 /軟骨全層比值 (articular calcified cartilage/total articular cartilage，ACC/TAC）。

1.3 主要試劑

EDTA－2Na(北京索萊寶科技有限公司），番紅O (北京索萊寶科技有限公司），固綠(北京華邁科生物技術(shù)有限責任公司）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS18．0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。Mankin評分采用x－±s表示，不同實驗組之間采用單因素方差分析，相鄰兩組之間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)改變

實驗組大鼠術(shù)后第2天，右后肢不能正?；顒?，靜止時呈足背翻轉(zhuǎn)向下姿勢(持續(xù)至第2周末），在運動過程中不能配合其它肢體協(xié)同運動、呈被動拖動、癱瘓狀態(tài);針刺右側(cè)大腿前外側(cè)無躲避反應(yīng)，針刺右側(cè)足背及左側(cè)下肢有躲避反應(yīng)。術(shù)后第4天，模型大鼠運動時右后肢呈外展、被動劃步姿勢。1周后模型大鼠運動時右后肢呈外展位劃步姿勢、足背翻轉(zhuǎn)與復(fù)位相交替(彩插2圖1）。第2周后，模型大鼠靜止時右足背正常姿勢，運動時呈外展位劃步姿勢、偶然出現(xiàn)足背翻轉(zhuǎn)。第6周后模型大鼠右后肢活動仍呈劃步姿勢，但足背恢復(fù)正常位置。第9周后，模型大鼠右后肢活動基本恢復(fù)正常姿勢。此過程中，右后肢大腿前外側(cè)始終針刺無躲避反應(yīng)。

術(shù)后1周末，實驗組大鼠運動功能Tarlov評分達到4分的有10只(55．6%），術(shù)后第2周末所有大鼠運動功能達到4分(100%）。

對照組大鼠術(shù)后活動正常。

2.2 股骨下端大體形態(tài)變化

實驗組大鼠術(shù)后第2周末右后肢股骨下端關(guān)節(jié)面較為光滑，髕面較窄、髕面中間凹陷較深;術(shù)后第6周末右后肢股骨下端關(guān)節(jié)面欠光滑，髕面開始變寬、髕面中間凹陷開始變淺，失去正常光澤，色澤不均;術(shù)后第10周末右后肢股骨下端關(guān)節(jié)面不光滑，髕面變寬、髕面中間凹陷變淺，色澤不均，透亮度下降(彩插2圖2）。

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下，對照組HE染色，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)層次清晰，著色均勻，潮線完整。番紅O/固綠染色，軟骨著色為紅色，著色均勻。

實驗組HE染色，關(guān)節(jié)軟骨面粗糙，軟骨著色不均勻;軟骨細胞減少、排列紊亂(15例，83．3%）;出現(xiàn)潮線復(fù)制、漂移和中斷的現(xiàn)象(10例，55．6%）。番紅O/固綠染色，軟骨層著色不均勻，著色變淺(17例，94．4%），在高倍鏡下觀察潮線復(fù)制、漂移和中斷現(xiàn)象比HE染色觀察更為明顯(12例，66．7%）。上述變化隨時間推移呈加重趨勢。各時間點Mankin評分結(jié)果(見表1）。

表1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分結(jié)果比較Tab．1 Comparison of Mankin score in knee articular cartilage in rats

對照組于術(shù)后第2周、6周、10周關(guān)節(jié)軟骨ACC/TAC值分別為37．96±3．92、40．04±4．65、40．82±5．39，實驗組于術(shù)后第2周、6周、10周關(guān)節(jié)軟骨 ACC/TAC值依次為36．58±5．41、50．39± 6．55、57．97±5．36。實驗組6周與10周大鼠關(guān)節(jié)軟骨ACC/TAC值較實驗組2周及對照各組均顯著升高(F=20．49，P ＜0．01，t=3．64～8．13，P ＜0．01）。實驗組關(guān)節(jié)軟骨ACC/TAC值隨時間推移呈逐漸增大(t=5．25～8．13，P＜0．05）。

3 討論

3.1 感覺缺失與關(guān)節(jié)軟骨損傷

骨關(guān)節(jié)炎可以涉及到全身多個關(guān)節(jié)，其中以膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱(如頸椎和腰椎）等承重關(guān)節(jié)最為常見［6］。雖然骨關(guān)節(jié)炎的病因尚不是很清楚，但其主要的危險因素已經(jīng)得到流行病學(xué)確認，如年齡、性別、遺傳、職業(yè)、肥胖、運動及生物力學(xué)異常等［1－3］。骨關(guān)節(jié)炎的核心病理改變是軟骨的損傷。各種危險因素通過不同方式作用于關(guān)節(jié)軟骨，引起軟骨細胞凋亡、細胞外基質(zhì)分解代謝、自身免疫等病理改變，最終導(dǎo)致軟骨的損傷［7］。關(guān)節(jié)不穩(wěn)可能在軟骨損傷中扮演著重要角色。

反射弧的完整是保證骨骼肌及關(guān)節(jié)正常運動的基本條件和前提，也是維持關(guān)節(jié)應(yīng)力平衡的基礎(chǔ)。傳入神經(jīng)損傷引起的傳入信息的缺失、特別是本體感覺功能的喪失，會導(dǎo)致骨骼肌肌張力、協(xié)同運動、關(guān)節(jié)初始狀態(tài)及應(yīng)力紊亂，引起關(guān)節(jié)功能紊亂，進而可引起軟骨損傷。有臨床資料顯示，OA患者均存在不同程度的本體感覺誤差與功能障礙;而且對OA患者進行本體感覺康復(fù)訓(xùn)練，患者關(guān)節(jié)周圍的肌力、穩(wěn)定性、反應(yīng)速度等都有所提高，臨床癥狀得到緩解［4－5］。間接證實上述傳入神經(jīng)損傷引起關(guān)節(jié)功能紊亂及關(guān)節(jié)軟骨損傷的推斷。提示本體感覺障礙可能參與了OA的形成與發(fā)展。研究探討本體感覺功能障礙對關(guān)節(jié)軟骨的影響，可有助于進一步認識OA的病理機制，對OA的防治具有積極意義。

本實驗研究結(jié)果顯示，實驗動物關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)不同程度損傷，并隨時間推移呈進行性加重趨勢，表現(xiàn)為軟骨著色不均勻、軟骨細胞減少、細胞排列紊亂，潮線復(fù)制、漂移和中斷等現(xiàn)象，與經(jīng)典OA的病理改變一致［8－9］，也與感覺障礙可引起關(guān)節(jié)軟骨炎性反應(yīng)的觀點一致［10－11］。脊神經(jīng)后根切斷可以造成關(guān)節(jié)應(yīng)力平衡失調(diào)、進而引起關(guān)節(jié)軟骨損傷。各種原因引起的感覺障礙、特別是本體感覺功能障礙，可能是OA的始發(fā)或伴發(fā)因素。

3.2 感覺部分障礙動物模型的設(shè)計及特點

經(jīng)典OA動物模型大多通過效應(yīng)器損傷引起關(guān)節(jié)不穩(wěn)、進而引起關(guān)節(jié)高應(yīng)力或低應(yīng)力變化，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷。但是，通過損傷效應(yīng)器誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的造模方法不可避免地會引起關(guān)節(jié)的出血、直接損傷以及炎癥，影響骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨、滑膜的生化代謝，干擾骨關(guān)節(jié)炎的病理變化［12］。大鼠L3、L4脊神經(jīng)后根參與了股神經(jīng)(L2～L5）與坐骨神經(jīng)(L3、L6）［13－14］的形成?；诜瓷浠〖氨倔w感覺在骨骼肌運動中的調(diào)節(jié)作用，我們設(shè)計了L3、L4脊神經(jīng)后根切斷大鼠動物模型，并觀察發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨損傷退變特點及規(guī)律。將L3、L4脊神經(jīng)后根切斷，可使大鼠手術(shù)側(cè)后肢局部傳入神經(jīng)阻斷，改變了膝關(guān)節(jié)周圍骨骼肌肌張力及協(xié)同運動，造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)與關(guān)節(jié)應(yīng)力平衡失調(diào)，進而引起關(guān)節(jié)軟骨損傷。其核心在于本體感覺功能的缺失。而一般痛溫覺障礙引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷稱為夏科氏關(guān)節(jié)病，是由脊髓空洞癥、脊髓脊膜膨出、脊柱脊髓損傷、糖尿病等疾病造成的神經(jīng)系統(tǒng)病變而引起的無痛性關(guān)節(jié)病。主要表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)無痛性的腫脹，活動時伴有骨摩擦音，患肢痛溫覺障礙，但觸覺和深感覺正常［15－16］。由于夏科氏關(guān)節(jié)病患者早期癥狀不明顯，故很少在發(fā)病早期得到治療，多以關(guān)節(jié)炎就診于骨科、風濕科［17］。不具有OA患者早期間斷性隱痛及關(guān)節(jié)僵硬的體征及特點。無痛覺保護是夏科氏關(guān)節(jié)病的主要特征。

本實驗動物模型與夏科氏關(guān)節(jié)病的最大差別在于，前者是關(guān)節(jié)周圍部分感覺的缺失、特別是本體感覺功能缺失;后者是某一局部的痛覺整體缺失。L3、L4脊神經(jīng)后根切斷后，其前根所支配的大腿肌肌張力及協(xié)調(diào)運動發(fā)生障礙，但關(guān)節(jié)周圍的其余部分感覺仍然可以通過鄰近脊神經(jīng)后根傳入，通過脊髓固有束間接完成脊髓反射，通過功能鍛煉可以起到一定的代償作用。雖然這兩種感覺障礙均引起關(guān)節(jié)軟骨的退變，但應(yīng)該是兩種不同的病理機制及變化。本體感覺缺失可能是OA與夏科氏關(guān)節(jié)病的重要差別之一。

本實驗是在OA患者存在本體感覺誤差及前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上為進一步驗證本體感覺障礙影響關(guān)節(jié)軟骨代謝而設(shè)計進行的。由于在脊髓后根中存在多種感覺神經(jīng)纖維，分離區(qū)分脊神經(jīng)后根纖維成分并選擇切斷本體感覺纖維存在較高技術(shù)困難，也無法避免淺感覺神經(jīng)纖維的損傷，所以尚不能確定本體感覺在軟骨損傷中所承擔的比重。通過延長實驗時間、運動康復(fù)及本體感覺訓(xùn)練，結(jié)合損傷側(cè)肌電圖及關(guān)節(jié)軟骨變化特點及規(guī)律，將有助于對本體感覺在軟骨損傷中的作用、關(guān)節(jié)軟骨損傷的病因及機制作出合理的闡述，也會為臨床OA的預(yù)防治療提供參考和指導(dǎo)。

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Effect of dorsal rhizotomy on cartilage of degenerative changes in knee joint of rats

ZHANG Ying1，LIN Yi1，YAN He1，ZHANG Cai－xin1，SHI Xiao－di1，JIN Li－xin2
(1．Department of Clinical Medicine，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China; 2．Department of Anatomy，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China）

Objective To investigate the changing characteristics and rules of the different period of articular cartilage in rats after dorsal rhizotomy，and to verify the partial sensory disturbance can cause articular cartilage injury．Methods Thirty－three ten－month－old SPF male Wistar rats were randomly divided into experimental group(n=18）and control group(n=15）．The rats in the experimental group were sectioned the L3、L4 dorsal roots in the right．The rats in the control group were only incised the skin and paravertebral muscles．To observe the behavior changes in rats．At 2，6 and 10 weeks，the specimens of the right hind lower end of femur were drawn out to make paraffin sections，then HE staining and Safranin O/Fast Green staining．The changes and characteristics of the morphology of the articular cartilage was observed．Results With the prolonging of period，the right hind limb of the experimental rats through the change process of transient paralysis，coordination of movement disorders and active movement．In the experimental group，the patellar surface of right hind femur gradually became shallow and wide．The articular cartilage underwent rough，cells disorganizated，cells decreased，and duplicated drifted and interrupted tide line．The ratios of ACC/TAC of the experimental group were gradually high(t=5．25～8．13，P ＜0．05）．Conclusion Dorsal rhizotomy can cause injuryand degenerative changes in articular cartilage．

Dorsal rhizotomy;Articular cartilage;Cartilage injury

R－332

A

1671－7856(2015）07－0016－04

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．004

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家級實驗教學(xué)示范中心創(chuàng)新實驗項目。

張影(1992－），女，本科生，E－mail：zhangying1611@163．com。

金利新(1967－），男，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：臨床應(yīng)用解剖，運動醫(yī)學(xué)，骨關(guān)節(jié)損傷與修復(fù)，E－mail：13061491213@126．com。

2015－06－12