三轉(zhuǎn)基因銀屑病小鼠模型建立與表型分析

高 祥，劉 寧，葛文萍，潘 爍，張海濤，張連峰，董 偉

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

三轉(zhuǎn)基因銀屑病小鼠模型建立與表型分析

高 祥，劉 寧，葛文萍，潘 爍，張海濤，張連峰，董 偉

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的尿激酶型纖溶酶激活劑(PLAU）、尿激酶型纖溶酶激活劑受體(PLAUR）和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3）是參與銀屑病病理發(fā)生的重要基因。本文目的是制備皮膚特異性表達(dá)PLAU、PLAUR和STAT3三種基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，建立可進(jìn)行性再現(xiàn)銀屑病病理進(jìn)程的小鼠模型。方法將PLAU、PLAUR和STAT3基因分別插入牛角蛋白5啟動(dòng)子(BK5）下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，通過顯微注射法建立在皮膚組織同時(shí)高表達(dá)PLAU、PLAUR和STAT3三種基因的轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠。利用PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型，Western blot檢測基因表達(dá)水平，HE染色觀察皮膚病理表型。結(jié)果 PLAU、PLAUR和STAT3三種基因在選定的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織均有明顯表達(dá);轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠相比表皮狀態(tài)差，炎癥明顯;4月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠真皮變簿，表皮過度角化、棘層增厚，毛囊減少、發(fā)育異常、部分毛囊內(nèi)未見毛干，角化不全區(qū)域內(nèi)可見Munro氏小膿腫，真皮炎細(xì)胞浸潤。結(jié)論建立了穩(wěn)定傳代的皮膚特異性表達(dá)PLAU、PLAUR和STAT3基因的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，轉(zhuǎn)基因小鼠具有進(jìn)行性的銀屑病表型，可以作為多病因綜合銀屑病小鼠模型。

銀屑病;信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3;尿激酶型纖溶酶激活劑;轉(zhuǎn)基因小鼠

銀屑病(牛皮癬，psoriasis）是一種以表皮過度增生和真皮慢性炎癥反應(yīng)為特征的常見皮膚病。白色人種發(fā)病率較高約為2%～5%，黃種人發(fā)病率較低約為0．5%，難根治，易復(fù)發(fā)。目前發(fā)病原因不明，與呼吸道感染，胃炎，飲食習(xí)慣，精神緊張、憂慮，不當(dāng)使用激素藥物等有關(guān)。有兩方面的病理特征，一方面是真皮慢性炎癥反應(yīng)，包括T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，炎癥因子：比如IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－23分泌增加等［1－2］。另一方面，是表皮過度增生，包括一些與表皮增生相關(guān)的血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA），雙調(diào)蛋白(AREG）等高表達(dá)［3－4］。銀屑病是人類特有的一類疾病，在動(dòng)物中少見，銀屑病動(dòng)物模型的制作主要采用化學(xué)制劑誘導(dǎo)，基因修飾或組織移植等方式制備，可以在一定程度上模擬銀屑癬的病理表型、慢性炎癥等［4－7］，但是各有優(yōu)缺點(diǎn)，銀屑病藥物評價(jià)需要一種既有表皮過度增生因素又有慢性炎癥因素參與的多病因動(dòng)物模型的研發(fā)。

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是STAT轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，JAK/STAT信號(hào)通路是大部分細(xì)胞因子，包括IL2、IL7、IL12、IL10、IL21等發(fā)揮生物學(xué)作用的核心通路，STAT3調(diào)控CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th17、Treg細(xì)胞和B細(xì)胞等多種淋巴細(xì)胞的分化與成熟，與炎癥關(guān)系密切［8］。STAT3參與皮膚傷口的愈合、角質(zhì)細(xì)胞遷移、毛囊生長、抵抗皮膚的放射損傷等，皮膚轉(zhuǎn)基因表達(dá)活化的STAT3可引發(fā)類似銀屑病的病變，而抑制STAT3表達(dá)可以改善銀屑病癥狀［9］，推測，STAT3參與表皮過度增生和真皮慢性炎癥過程，也是重要的治療靶點(diǎn)之一。

血纖維蛋白溶酶原，血纖維蛋白溶酶，抑制因子，激活因子細(xì)胞受體是一個(gè)多基因成員參與的體系，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的水解與細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)，參與血管生成、腫瘤發(fā)生、皮膚發(fā)育等多種過程［10］。尿激酶型纖溶酶激活劑(plasminogen activator，urokinase，PLAU）是多種血纖維蛋白溶酶原的激活因子，PLAU和 PLAU受體(plasminogen activator，urokinase receptor，PLAUR，）也叫做UPAR或CD87，都在皮膚組織表達(dá)［11－12］。PLAU/PLAUR表達(dá)升高可能是銀屑病發(fā)生的重要原因［12］。

本文利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將 STAT3、PLAU和PLAUR同時(shí)轉(zhuǎn)入小鼠基因組，建立皮膚特異表達(dá)三種基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠表現(xiàn)毛囊發(fā)育異常、表皮過度增生和慢性炎癥，可以作為多病因綜合小鼠銀屑病。

1 材料和方法

1.1 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三個(gè)基因的cDNA購買自O(shè)rigene公司，用PCR的方法克隆三種基因的開放閱讀框，并在兩端引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ(寶生物工程有限公司中國）和EcoRV(寶生物工程有限公司中國），插入pMD－18T Simple Vector(寶生物工程有限公司中國），測序證實(shí)序列正確。以KpnⅠ和EcoRV進(jìn)行酶切回收三種基因片段，均插入牛角蛋白5(bovine keratin 5）啟動(dòng)子下游構(gòu)建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種表達(dá)載體。構(gòu)建成功后，再用SalⅠ(寶生物工程有限公司中國）將其線形化。調(diào)整轉(zhuǎn)基因片段濃度至4 ng/μL，用顯微注射法(TE2000－U顯微注射儀）將線性化的三種混合后的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備三轉(zhuǎn)基因小鼠［13］。C57BL/6J小鼠購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司【SCXK(京）2014－0001】。實(shí)驗(yàn)室使用許可【SYXK(京）2013－0004】。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS－GC－2015－002。

1.2 PCR鑒定三轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在9～14日齡時(shí)用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，利用特異引物通過PCR法進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)條件：鼠尾DNA模板10～100 ng，PLAU基因上游引物5’GGGCAGCACTGTGAAATAGATAAG下游引物為5’CCCAGGTAGACGATGTAGTCCTC;PLAUR基因上游引物為5’GATTGCCGTGTGGAAGAGTG下游引物為5’TCAGGAAGTGGAAGGTGTCG;STAT3基因上游引物為5’GAGAGTCAAGACTGGGCATATGC下游引物為5’CCAGCTCACTCACAATGCTTCTC。PCR反應(yīng)體系20 μL(試劑購自寶生物工程有限公司，中國）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。目的基因片段分別為 PLAU基因545 bp，PLAUR基因475 bp，STAT3基因550 bp。

1.3 Western blot檢測鑒定三種基因的表達(dá)

提取三轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠皮膚總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上(Millipore美國），置于5%脫脂奶粉封閉液，分別用兔抗人PLAU抗體(Abcam）、兔抗人PLAUR抗體(Abcam）、鼠抗鼠STAT3抗體(Cell Signaling）檢測基因的表達(dá)水平。采用辣根過氧化物酶(Hrp）－耦聯(lián)的羊抗兔抗體和羊抗鼠抗體結(jié)合一抗(Pierce，USA），用Hrp－耦聯(lián)的鼠抗β－actin單克隆抗體做為內(nèi)參(康成生物，中國）。

1.4 轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠的大體觀察

選用同齡同性別的轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和野生型小鼠，SPF級動(dòng)物房，同等條件正常飼養(yǎng)，定期觀察兩組小鼠表皮毛發(fā)生長情況，并拍照記錄。

1.5 HE染色觀察4月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠的皮膚組織

選用4月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同齡野生小鼠，取小鼠背部及腹部皮膚，固定在10%中性甲醛中48 h，進(jìn)行修塊、脫水、包埋、切片、HE染色和鏡下觀察(Nikon顯微鏡，日本和 Leica MZ16F體視鏡，德國）［14］。

2 結(jié)果

2.1 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因表達(dá)載體的構(gòu)建

用PCR克隆的人PLAU，PLAUR及鼠STAT3基因，測序結(jié)果表明同已報(bào)道的序列完全一致(PLAU Gene ID：5328，NM－002658;PLAUR Gene ID：5329，NM－002659;STAT3 Gene ID：20848，NM－011486;）。將三種基因分別插入皮膚特異的表達(dá)啟動(dòng)子BK5下游，構(gòu)建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3基因三種轉(zhuǎn)基因載體(圖1）。

2.2 三轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小

鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增目的基因片段來檢測轉(zhuǎn)基因小鼠，三種目的基因片段分別為PLAU基因545 bp，PLAUR基因475 bp，STAT3基因550 bp(圖2），共得到3只首建鼠均可傳代。

圖1 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3基因轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體Fig．1 PLAU，PLAUR，STAT3 transgenic construct

圖2 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型Note：P，positive control;N，negative control;W，blank control; M，DNA molecular weight marker;Lane 1，4，7 the positive transgenic mice;Lane 2，3，5，6，8 negative．Fig．2 Genotyping the transgenic mice by PCR

2.3 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因的表達(dá)

首先用Western blot分析3個(gè)系1月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中人PLAU，PLAUR及鼠STAT3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示三種蛋白在皮膚中均有表達(dá)，表達(dá)量各有差別(圖3），選取三種基因均有較高表達(dá)水平的TG7保種繁殖，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡野生型小鼠表皮差異

先用Western blot結(jié)果顯示TG4皮膚中主要高表達(dá)PLAU和STAT3，而TG7皮膚中PLAU，PLAUR和STAT3均高表達(dá)。和TG4小鼠比較TG7小鼠表型更明顯，說明三種基因同時(shí)表達(dá)對病理發(fā)生是關(guān)鍵。TG7小鼠在1月齡就表現(xiàn)腹部毛發(fā)稀疏，無光澤，表皮粗糙，至4月齡表現(xiàn)典型腹部皮膚紅腫和炎癥(圖4）。皮膚炎癥主要表現(xiàn)在腹部，背部表型不明顯。除皮炎表型外，小鼠生育和發(fā)育無異常。

注：WT：野生型小鼠;TG1、TG4、TG7：轉(zhuǎn)基因小鼠;內(nèi)參：β－actin。

圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠表皮表型Fig．4 The phenotype of the transgenic mouse

2.5 皮膚病理表型(圖見彩插1）

選用4月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同齡野生小鼠，采取頸椎脫臼法犧牲，取背部及腹部皮膚，HE染色，鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠真皮變簿(圖5A），表皮過度角化和棘層增厚(圖5B），毛囊減少和發(fā)育異常，部分毛囊內(nèi)未見毛干(圖5C），角化不全區(qū)域內(nèi)可見中性白細(xì)胞構(gòu)成的小膿腫(Munro氏小膿腫）和真皮炎細(xì)胞浸潤((圖5D）。

3 討論

真皮慢性炎癥反應(yīng)和表皮過度增生是銀屑病的2個(gè)典型的病理特征，參與銀屑病的病理發(fā)生因素很多，如T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，炎癥因子分泌增加［1－2］，一些與表皮增生相關(guān)的因子表達(dá)增多，如tPA，AREG，STAT3，PLAU，PLAUR［3－4，11－12］。利用一些具有刺激和損傷作用的化學(xué)物質(zhì)對動(dòng)物皮膚進(jìn)行處理，比如，可以用 10%十二烷基硫酸鈉(SDS）涂抹小鼠背部皮膚造成銀屑病樣體征，但是這種模型一方面病理發(fā)生機(jī)制與銀屑病病理發(fā)生機(jī)制差別較大，主要局限于病理表型的模仿;另一方面，在移出化學(xué)物質(zhì)后，動(dòng)物會(huì)自行痊愈，沒有漸進(jìn)性的特點(diǎn)，留給藥物治療的觀察時(shí)間也比較短。通過轉(zhuǎn)基因的方式在皮膚局部表達(dá)參與銀屑病發(fā)生的一些基因，可以在病因和病理發(fā)生過程方面更好的模仿銀屑病。針對參與銀屑病發(fā)生的一些基因單獨(dú)轉(zhuǎn)基因有時(shí)候并不能引發(fā)皮膚銀屑病樣體征，比如，Wnt5a基因在銀屑病發(fā)病過程高表達(dá)，但是在皮膚轉(zhuǎn)基因表達(dá)Wnt5a只觀察到毛囊發(fā)育異常，而沒有銀屑病樣體征［15］。所以，將多種相關(guān)基因一起轉(zhuǎn)基因可以整合多種病因的作用，更真實(shí)的模仿銀屑病。

PLAU，PLAUR和STAT3都是參與銀屑病病理發(fā)生的重要基因［9，11－12］。牛角蛋白 5啟動(dòng)子(BK5）是常用的皮膚組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子［16］。本文利用BK5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)PLAU，PLAUR和STAT3的表達(dá)，建立了在皮膚中同時(shí)表達(dá)這三種基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(圖1－3）。和野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠在1月齡就表現(xiàn)腹部毛發(fā)稀疏，無光澤，表皮粗糙，至4月齡表現(xiàn)典型腹部皮膚紅腫和炎癥(圖4）。轉(zhuǎn)基因小鼠真皮變簿，表皮過度角化和棘層增厚，毛囊減少和發(fā)育異常，角化不全區(qū)域內(nèi)可見中性白細(xì)胞構(gòu)成的Munro氏小膿腫和真皮炎細(xì)胞浸潤(圖5）。轉(zhuǎn)基因小鼠在病因、炎癥和皮膚損傷三方面都能表現(xiàn)銀屑病特征，并且具有累進(jìn)性的特點(diǎn)，可以作為多病因綜合銀屑病小鼠模型。

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Establishment of the psoriasis transgenic mouse model and analysis of the phenotype

GAO Xiang，LIU Ning，GE Wen－ping，PAN Shuo，ZHANG Hai－tao，ZHANG Lian－feng，DONG Wei
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective To develop a model that could copy the pathological development of psoriasis，the tripletransgenic mice that harboring Plasminogen activator，urokinase(PLAU），PLAU receptor(PLAUR）and signal transducer and activator of transcription 3(STAT3）were generated．They are the important genes involved in the pathological development of psoriasis．Methods The transgenic plasmid was constructed by insertion of the PLAU，PLAUR and STAT3 into the downstream bovine keratin 5 promoter respectively．The transgenic mouse was produced by microinjection and the genotyping was detected by PCR．The expression level of the transgenic gene was determined by Western blotting．The pathological changes were observed by HE staining．Results One mouse line was selected with over expression of the PLAU，PLAUR and STAT3 in the tissue of skin．The transgenic mice showed decreased dermal layer，a hyperkeratinized cuticular layer and increased stratum spinosum．The number of hair follicle was reduced and developed abnormally in the transgenic mice．The Munro abscess in the dermal layer and the increased inflammatory cell infiltrates in dermal layer werealso observed in the transgenic mice．Conclusions A transgenic mouse line was produced and passage stably，which expressed the PLAU，PLAUR and STAT3 in the tissue of skin and developed the psoriasis progressively．All of our results suggested that the transgenic mice were a useful animal model for psoriasis．

Psoriasis;Signal transducer and activator of transcription 3;Plasminogen activator urokinase; Transgenic mice

R－332

A

1671－7856(2015）07－0011－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．003

國家科技支撐計(jì)劃課題“基因工程大鼠模型的研發(fā)與示范”(2014BAI02B01）。

2015－06－05