失眠增加心血管病致病因子的研究

袁 蓉，王 階，郭麗麗，林 飛

(1．中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2．北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

失眠增加心血管病致病因子的研究

袁 蓉1，2，王 階1，郭麗麗1，林 飛1

(1．中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2．北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

目的觀察睡眠剝奪(sleep deprivation，SD）對大鼠心血管病致病因子的影響，初步為中醫(yī)安神治療心血管病機制的研究提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。方法 16只大鼠隨機均分為空白對照組(control check，CC）和睡眠剝奪組(SD）。測量CC組及SD組大鼠SD前、SD后2 d、5 d、7 d體重及心電圖，并眼球取血測血清褪黑素(MT）、內(nèi)皮素－1(ET－1）、炎癥相關(guān)因子白介素6(IL－6）、腫瘤壞死因子(TNF－α）等。結(jié)果 與SD前比較，SD組大鼠體重明顯減輕，CC組大鼠體重明顯增加，SD后5 d及7 d，SD組大鼠體重與CC組比較明顯減輕(P＜0．05）;與CC組比較，SD組大鼠SD后5 d TNF－α升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05）;隨SD時間的延長心率逐漸增快，QTc間期逐漸延長，MT逐漸降低，ET－1、IL－6、TNF－α逐漸升高，7 d時兩組的各指標差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05）。結(jié)論長期失眠可使體重減輕，心率明顯加快，QTc間期延長，褪黑素水平降低，內(nèi)皮素和炎癥因子升高，增加心血管病致病因子，為進一步研究安神中藥對心血管病的作用提供基礎(chǔ)實驗支持。

睡眠剝奪;冠心病;心率;內(nèi)皮;炎癥

失眠是心血管疾病風險的獨立預測因子，已成為亞臨床心臟疾病的標志［1］，大規(guī)模的人群調(diào)查已發(fā)現(xiàn)失眠和逐漸增高的心梗、心衰的危險因素相關(guān)［2－4］，失眠可引起機體的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，交感神經(jīng)興奮，內(nèi)源性激素分泌紊亂，內(nèi)皮功能紊亂等［5］，可能影響心血管病相關(guān)的心率、內(nèi)皮功能、炎癥反應及同時與睡眠相關(guān)的褪黑素水平，而心率是心肌耗氧量的最主要決定因素，也是心血管疾病的獨立危險因素［6］;內(nèi)皮素對血管收縮，心肌缺血，血管損傷均會產(chǎn)生影響［7］;心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸也與炎癥反應有著密切的關(guān)系;褪黑素可影響心血管系統(tǒng)，具有抗高血壓、調(diào)節(jié)脂代謝、抗心肌損傷及保護血管內(nèi)皮的作用［8］。因此，本研究利用“小平臺水環(huán)境法”制備大鼠睡眠剝奪模型，觀察不同睡眠剝奪時間對心血管病相關(guān)的心率、內(nèi)皮素、褪黑素及炎癥因子的影響，試圖為中醫(yī)安神法治療心血管病的機制研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器及材料

Power Lab 4/30多導生理記錄儀，澳大利亞AD公司產(chǎn)品;Lab Chart 6軟件，澳大利亞AD公司產(chǎn)品;大鼠內(nèi)皮素放射免疫分析藥盒，批號S20083014;大鼠褪黑素酶連免疫分析藥盒，批號CSB－E11315r;IL－6酶聯(lián)免疫分析藥盒，批號EK3061－48T;大鼠TNF－α酶聯(lián)免疫分析藥盒，批號EK3821，均購于優(yōu)科卓越生物醫(yī)學技術(shù)(北京）有限公司。

1.2 動物分組及睡眠剝奪sleep deprivation(SD）模型的建立

SPF級Wistar雄性大鼠16只，體重270～290 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXX (京）2012－0001】，實驗在廣安門醫(yī)院實驗動物中心動物實驗設(shè)施進行【SYXK(京）2014－0041】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分為睡眠剝奪組(SD組）和空白對照組(control check，CC），每組8只。利用“小平臺水環(huán)境法”制備大鼠睡眠剝奪模型。用直徑80 cm的水箱，底部放置12個高6 cm、直徑3 cm的圓形小平臺，每個平臺間隔距離15 cm，箱內(nèi)注有水，水面低于平臺1 cm，頂部用鐵絲網(wǎng)蓋住，大鼠不能逃脫但可自由進食、飲水。大鼠可在平臺間自由活動，但當進入睡眠時，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成睡眠剝奪。每日換水添食，室溫保持23℃～25℃。將SD組大鼠置于24 h擬光照環(huán)境中，進行連續(xù)7 d的睡眠剝奪;CC組模擬正常作息時間，飼養(yǎng)在每天12 h擬光照，12 h黑暗的環(huán)境中，不給予任何干預，正常飼養(yǎng)。每日定時記錄大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境的溫度以及觀察SD組、CC組大鼠在行為、反應能力，進食及皮毛光澤等方面的差異，并于SD前及SD后2、5、7 d進行稱重，心電圖(ECG）檢查和眼球取血檢測。

1.3 心電活動檢查

所有大鼠于SD前、SD后2、5、7 d固定大鼠，在清醒狀態(tài)下多導生理記錄儀連接大鼠肢體記錄心電圖并進行分析，于Lab Chart 6上記錄心率并計算矯正的QTc間期，QTc=QT/√RR。

1.4 血清檢測

所有大鼠于SD前、SD后2、5、7 d眼球取血1 mL于EP管內(nèi)，靜置40 min，3500 r/min離心10 min后取上清液凍存于－80℃冰箱保存待測。按試劑盒說明書用ELISA法檢測褪黑素(MT）、內(nèi)皮素－1(ET－1）、白介素6(IL－6）、腫瘤壞死因子(TNF－α）的濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17．0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標準差(±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠睡眠剝奪后一般狀態(tài)觀察

CC組大鼠正常，精神狀態(tài)良好，活動自如。SD組大鼠睡眠剝奪2 d時興奮性增高，對刺激反應敏捷;5 d時興奮性增高，狂躁，至睡眠剝奪第7天，大鼠表現(xiàn)出狂躁，易“激惹”，出現(xiàn)尖叫，撕咬，攻擊行為，精神狀態(tài)差，消瘦，皮毛無光澤。

2.2 睡眠剝奪對體重影響

與SD前比較，SD組大鼠體重明顯減輕，SD后5、7 d，SD組與 CC組比較體重明顯減輕，P ＜0．01，均有顯著性差異。

2.3 心電活動檢查結(jié)果CC組正常大鼠心電圖無明顯變化，SD組大鼠心電圖表現(xiàn)出心率增快，QT間期延長，且隨剝奪時間延長而心率加快，QTc逐漸延長，7 d時兩組比較P＜0．01，有顯著性差異。

2.4 血清檢測結(jié)果SD組大鼠ET－1、IL－6、TNF－α水平隨時間的延長而逐漸升高，7 d時兩組比較差異有統(tǒng)計學意義;MT水平隨時間延長而逐漸降低，7 d時兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 睡眠剝奪(SD）對體重的影響Tab．1 The effect of sleep deprivation on the weight

表2 睡眠剝奪(SD）對心率和QTc的影響Tab．2 The effect of sleep deprivation on HR and QTc

注：與對照組比較，*P＜0．05，＊＊P＜0．01。Note：Compared with control group，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01．

注：與對照組比較，*P＜0．05，＊＊P ＜0．01。Note：Compared with control group，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01．

3 討論

本實驗針對心血管病相關(guān)的心率、內(nèi)皮素，以及IL－6、TNF－α等炎癥因子和具有保護作用的褪黑素進行研究，尋找睡眠剝奪后與心血管病相關(guān)的致病因子的改變，結(jié)果顯示睡眠剝奪7 d時機體出現(xiàn)各種病理變化，說明失眠可導致心血管病致病因子變化而增加心血管風險，為安神中藥治療心血管病提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

快速心率是心血管病的獨立危險因子，并成為心肌缺血和心律失常的危險因素［6］。睡眠剝奪影響了固有生物節(jié)律使機體處于應激狀態(tài)，自主神經(jīng)功能紊亂，持久的交感神經(jīng)興奮可能會加快心率，對心臟自主神經(jīng)平衡產(chǎn)生影響，致室顫閾降低，同時QT間期延長容易誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)性室速，易引起室顫、暈厥、猝死［9］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪7 d時心率增快，QT間期延長，與對照組比較均有統(tǒng)計學差異，說明失眠可能通過交感神經(jīng)興奮引起心率加快，損傷心肌細胞導致部分心肌復極時間延長，QT間期延長，從而易誘發(fā)心律失常。

血管內(nèi)皮功能在心血管系統(tǒng)中起著重要作用。內(nèi)皮損傷，各種炎性細胞聚集、侵潤，平滑肌細胞和成纖維細胞增生遷移，血管內(nèi)皮細胞釋放ET－1可導致血管舒縮功能失調(diào)、血小板凝聚等病理生理改變，促進動脈粥樣硬化和血栓形成［10］。其中內(nèi)皮素的升高在冠狀動脈粥樣硬化及缺血性心臟病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，并且會影響心梗、心衰、高血壓的預后［11］。因此本實驗研究發(fā)現(xiàn)SD后7 d時內(nèi)皮素顯著升高，說明失眠可損傷內(nèi)皮功能，引起一系列高血壓、動脈粥樣硬化、血栓形成等病理變化而增加心血管風險。

炎癥反應是機體對損傷因子所產(chǎn)生的防御反應，與高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病有關(guān)。IL－6作為前炎癥細胞因子，可通過體液和細胞免疫功能影響炎癥和組織損傷，在炎癥反應中起核心調(diào)節(jié)作用，是動脈粥樣硬化的重要炎癥因子;TNF－α作為前炎癥細胞因子可調(diào)節(jié)脂類代謝，影響內(nèi)皮功能，并刺激自身和IL－6的表達，與動脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)，其濃度與病情嚴重程度成正比，因此IL－6、TNF－α等炎癥標志物的水平能夠預測冠心病病情及病變程度［12］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)SD后7 d IL－6和TNF－α均顯著升高，說明失眠可通過炎癥損傷作用于心血管系統(tǒng)。

褪黑素作為影響睡眠的重要激素與心血管疾病有著密切聯(lián)系。褪黑素不僅可以直接調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的活動，還可影響其他所有激素的分泌間接調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的活動，有著抗應激、抗氧化、抑制炎癥反應的作用［8］。因此本實驗研究發(fā)現(xiàn)中褪黑素在睡眠剝奪7 d時顯著下降，說明失眠可損傷心血管系統(tǒng)的保護作用，各種危險因素之間相互影響，構(gòu)成一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，通過多種途徑影響心血管病的發(fā)生、發(fā)展和預后。

綜上，本實驗證實了失眠可通過加快心率，延長QT間期，升高內(nèi)皮素和炎癥因子，減少褪黑素等多途徑增加心血管病致病因子。失眠時交感神經(jīng)過度興奮，可能引起兒茶酚胺分泌增加，血小板黏附聚集性增強，血液粘滯度增加，增加血栓形成危險因素［10］。目前中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)失眠引起的危險因素方面有良好優(yōu)勢，可作用于心肌膜上各種離子通道，影響心肌細胞膜受體及酶類，影響自主神經(jīng)功能，改善心率，抗心律失常［13］，調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，抗炎、抗氧化，多途徑多靶點預防血栓形成、動脈粥樣硬化等發(fā)生［14］，因此，本實驗為進一步探討失眠對心血管病的影響機制及中醫(yī)安神方藥干預研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考資料，而其具體機制仍需進一步研究。

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Effect of insomnia on rat cardiovascular disease factors

YUAN Rong1，2，WANG Jie1，GUO Li－li1，LIN Fei1(1．Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical sciences，Beijing 100053，China; 2．Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，Chiina）

Objective Investigate the effect of insomnia on cardiovascular disease factors and offer the experimental evidence for treating cardiovascular disease with traditional Chinese medicine tranquillization methods．Methods Sixteen Wistar rats were randomly divided into two groups named sleep deprivation(SD）group and normal control check(CC）group．Body weight and electrocardiogram were recorded and serum concentrations of melatonin(MT），endothelin－1(ET－1），IL－6 and TNF－α were tested before SD and 2 days，5 days，7 days after SD．Results Body weight decreased in SD group while increased in CC group．Compared with CC group，body weight of SD rats decreased significantly in 5 days and 7 days after SD(P ＜0．05）．Compared with CC group，TNF－α increased significantly in 5 days (P ＜0．05）．With the time，heart rate accelerate and QTc were prolonged，MT decreased while ET－1，IL6，TNF－α increased significantly in 7 days after SD(P＜0．05）．Conclusion Long term insomnia would decrease body weight and MT，while increase heart rate，QTc，ET－1 and inflammatory factors，which increase cardiovascular disease factors．It provided the experimental evidence for the study on traditional Chinese medicine tranquillization methods in the treatment of cardiovascular disease．

Sleep deprivation;Coronary heart disease;Heart rate;Endothelium;Inflammation

王階(1956－），男，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心血管，E－mail：wangjie0103@126．com。

R－332

A

1671－7856(2015）07－0007－04

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．002

科技部“重大新藥創(chuàng)制”專項(2012ZX09102－201－006）。

袁蓉(1991－），女，碩士生，研究方向：心血管。E－mail：yuanrong427@163．com。

2015－06－10