洗液對ELISA法檢測梅毒螺旋體特異性抗體結(jié)果的影響

閆朝春

(連云港市東方醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港222042)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡單且不需要特別昂貴的儀器設(shè)備而被臨床實驗室廣泛應(yīng)用[1，2]，目前梅毒螺旋體特異性抗體 (Treponema pallidum specific antibody,TPAb)的檢測大多就采用此方法。ELISA法是一種固相載體包被的免疫標(biāo)記檢驗技術(shù)，其本身存在諸多影響因素，如標(biāo)本處理、試劑盒選擇、溫育條件、洗板方式等等[3，4]，一旦哪一步操作不好，結(jié)果就有可能產(chǎn)生偏差。本文就ELISA法檢測TP-Ab試驗中的洗液對檢驗結(jié)果的影響進(jìn)行了一番探討，旨在尋找最佳的洗滌方式，以便規(guī)范試驗操作,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的選擇 選取TP-Ab陽性標(biāo)本68例(OD>1.000)，陰性標(biāo)本 24 例(OD<0.010)，標(biāo)本均無溶血和脂血。

1.2 試劑與儀器 試劑為北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，批號為 N20140203，有效期為 2015-01；儀器為Addcare ELISA 600型酶免分析工作站，由煙臺艾德康生物科技有限公司提供；質(zhì)控品購自江蘇省臨床檢驗中心，規(guī)格為12mIU(2NCU)/ml，批號為201311003。

1.3 實驗方法 將選取的臨床陽性標(biāo)本用混合血清(OD小于0.005)稀釋至S/CO于0.8~1.3范圍內(nèi)進(jìn)行試驗，分別用蒸餾水、純凈水和自來水配制三種洗液，以平行試驗改變?nèi)N洗液對92例樣本(陰性24例，弱陽性42例，強(qiáng)陽性26例)進(jìn)行平行試驗。并以蒸餾水將洗液配制成不同濃度(濃度1：1:5，濃度 2：1:20，濃度 3：1:40，濃度 4：1:80)對 92 例樣本(陰性24例，弱陽性42例，強(qiáng)陽性26例)進(jìn)行試驗。洗板過程中注液體積為350μl,均浸泡30s。

1.4 統(tǒng)計處理 結(jié)果在Stata 9.2統(tǒng)計軟件包上進(jìn)行處理，計量資料均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同水質(zhì)的洗液對ELISA法檢測TP-Ab結(jié)果的影響 純凈水組與蒸餾水組弱陽性標(biāo)本的S/CO值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，自來水組弱陽性標(biāo)本的S/CO值高于蒸餾水組(P<0.05)，詳見表1；自來水組的陽性率分別高于蒸餾水組和純凈水組(P<0.05)，而純凈水組與蒸餾水組檢測陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，詳見表 2。

2.2 以蒸餾水配制不同濃度的洗液對ELISA法檢測TP-Ab結(jié)果的影響 高濃度的洗液造成試驗結(jié)果OD值偏低，陽性率降低；低濃度的洗液則使OD值升高，陽性率升高。結(jié)果詳見表3和表4。

2.3 不同洗液對ELISA法檢測梯度濃度TP-Ab質(zhì)控結(jié)果的影響 自來水配制的洗液結(jié)果高于蒸餾水，蒸餾水配制的洗液以1:20為標(biāo)準(zhǔn)，濃度越高，OD值偏低，濃度越低，OD值偏高。結(jié)果詳見表5。

表1 不同水質(zhì)的洗液對ELISA法檢測TP-Ab的OD值變化結(jié)果

表2 不同水質(zhì)的洗液對ELISA法檢測TP-Ab的結(jié)果陽性率

表3 不同濃度的洗液ELISA法檢測TP-Ab的OD值變化結(jié)果

表4 不同濃度的洗液ELISA法檢測TP-Ab的結(jié)果陽性率

表5 不同洗液對ELISA法檢測梯度濃度TP-Ab質(zhì)控結(jié)果(OD值)分析

3 討論

ELISA法操作簡單，靈敏度和特異性高，但影響因素也較多，如加樣量、洗板和溫度等等[5]。該方法為非均相免疫測定技術(shù),需要洗去非特異性結(jié)合或過量的抗原抗體反應(yīng)物,從而保證檢測結(jié)果的特異性[6],所以洗板也是其關(guān)鍵的一步，尤其是洗液的正確配制直接關(guān)系到洗板的質(zhì)量。

TP-Ab ELISA法檢測一般采用雙抗原夾心法，原理是將抗原預(yù)先包被在固相載體表面，其后按不同的步驟分別加入待檢抗體和酶標(biāo)抗原，充分反應(yīng)后經(jīng)適當(dāng)?shù)南礈?，使未與固相載體上包被的抗原結(jié)合的抗原抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物完全洗去，待加入相應(yīng)的底物后通過酶對底物的催化顯色程度來對標(biāo)本中的抗體進(jìn)行定性或定量[2，7]。在整個試驗過程中，洗滌起了重要作用，如果洗滌不充分(次數(shù)不夠或洗滌不干凈)，殘留在微孔板上的酶標(biāo)抗體中的酶會使后來加的無色底物液變成有色產(chǎn)物，產(chǎn)生了非特異性顯色反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[8，9]，并且洗滌次數(shù)越少越容易造成假陽性，尤其值得注意的是，試劑盒洗液的配制是由試劑廠家反復(fù)試驗驗證的，人為改變洗液配制的水質(zhì)及比例容易影響洗滌效果，使一些非特異性結(jié)合物沒有洗掉而造成假陽性；也可能造成固相結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物脫離，使檢測吸光度值降低造成假陰性[7]。本實驗佐證了用自來水配制洗滌液比用蒸餾水配制的容易造成假陽性結(jié)果(P<0.05)，而純凈水與蒸餾水無明顯差異(P>0.05)。原因也許就是謝毅[10]認(rèn)為的在一定范圍內(nèi)洗液離子強(qiáng)度高低與非特異性反應(yīng)的出現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)而影響檢測結(jié)果。所以,洗液成分[4]改變會造成與固相結(jié)合的抗原／抗體脫離的程度不同，從而影響檢測的靈敏度，使樣本檢測的OD值改變[11]。本實驗中用蒸餾水配制不同濃度的洗液檢測結(jié)果是高濃度的洗液造成OD值偏低，陽性率降低；低濃度的洗液則使OD值升高，陽性率升高，也證實了上述觀點。也有部分實驗室用自來水配制洗液，更有甚者直接以自來水代替洗液，此種做法都很危險,應(yīng)引起大家足夠的重視[12-15]。

[1]季育華,陶義訓(xùn).影響酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果的操作因素[J].檢驗醫(yī)學(xué),2006,21(增刊)47-49.

[2]陶義訓(xùn)主編.免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1995:71-74.

[3]周艷萍.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測法的質(zhì)量控制[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2009,6(14):1206-1207.

[4]白占杰.論酶聯(lián)免疫吸附試驗中影響因素解決方法[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2012,30(2):185-186.

[5]陳仁杰,胡海燕,嚴(yán)銀燕.ELISA一步法檢測梅毒抗體鉤狀效應(yīng)三例[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2008,26(02):215.

[6]孫家志.2種洗板方式對HBsAg檢測結(jié)果的影響[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(1):92-96.

[7]馬鳳蓮,張志民,史慧霞.增加洗板次數(shù)對HBsAb ELISA檢測結(jié)果的影響[J].中國誤診學(xué)雜志,2008,8(9):2103.

[8]譚立明.ELISA法檢測的影響因素及其對策[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(4):300-305.

[9]楊娜.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測影響因素探討[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(22):2558-2559.

[10]謝毅,宋琳,喻方敏,等.ELISA檢測HBsAg的非特異反應(yīng)因素分析[J].洛陽醫(yī)專學(xué)報,2002,20(3):186-188.

[11]馬鳳蓮,史惠霞.洗液成分不同對HbsAg ELISA檢測結(jié)果的影響[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2010,8(14):176-177.

[12]丁文,薛慶歡,吳文金,等.人為操作因素對酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝病毒血清標(biāo)志物影響的探討[J].中國實驗診斷學(xué),2010,14(7):1019-1022.

[13]余曉慧.酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀在二步法乙肝病毒表面抗原檢測中的應(yīng)用[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2011,29(1):97-98.

[14]劉祖勇.增加洗板次數(shù)對HBsAg ELISA檢測結(jié)果的影響[J].中國輸血雜志,2006,19(2):135-136.

[15]謝碌,崔江龍,王宏碧.ELISA法對乙肝六項檢測結(jié)果的影響及處理對策[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2011,29(1):83-84.