BMI-1蛋白在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及意義

葛熙 ，洪煜婧，趙枰

(1、南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通226001；2、南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)141班，江蘇 南通226019)

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一起源于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性疾病。臨床上分為慢性期、加速期和急變期，臨床上急性變是引起患者死亡的主要原因。尋找CML急性變的相關(guān)基因?qū)τ诮沂綜ML發(fā)生急性變的分子機(jī)制及探索治療的新靶點(diǎn)具有重要的意義。有研究表明，BMI-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1)基因表達(dá)增高的病例更易轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽1]。本文用免疫組化方法，檢測BMI1基因表達(dá)產(chǎn)物BMI-1蛋白在CML各期中的表達(dá)，初步探討B(tài)MI-1蛋白在CML中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 CML診斷及療效判定參照張之南主編 《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]。選擇2010年1月至2014年12月在南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科就診的門診和住院的CML患者41例，男29例，女12例，年齡42～79歲。其中慢性期(CML-CP)26例，加速期(CML-AP)6例，急變期(CM-BP)9例。加速期和急變期15例化療后完全緩解11例 (緩解組)，未緩解4例(未緩解組)。對照組10例來自本院健康志愿者，男7例，女3例，年齡48～70歲。

1.2 檢測方法 用免疫組織化學(xué)法檢測CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞BMI-1蛋白，BMI-1多克隆抗體為美國Santa Crus公司的產(chǎn)品，生物素標(biāo)記的羊抗小鼠二抗及SP免疫標(biāo)記試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。抽取骨髓液2ml，用EDTA抗凝，加入等量的人淋巴細(xì)胞分離液，以2 000r／min離心15min，分離出單個(gè)核細(xì)胞并涂片，干燥，室溫下用新鮮配制的丙酮溶液固定30 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01mol/L，pH7.4)漂洗3次；0.1%Triton 100通透10min，再用PBS漂洗3次，后根據(jù)試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。每一批實(shí)驗(yàn)同時(shí)做陽性及空白對照，陽性對照采用胃癌切片(由益源試劑公司提供)，以PBS代替一抗做空白對照檢測。

1.3 結(jié)果判定 細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核上著棕黃色顆粒狀彌漫或局灶分布者為陽性細(xì)胞。參照全國免疫組化技術(shù)診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會意見，根據(jù)陽性所占的比例及顯色程度對陽性細(xì)胞進(jìn)行積分：

(1)細(xì)胞質(zhì)和(或)核內(nèi)見淺黃色顆粒，明顯高于背景底色，陽性顆粒所占細(xì)胞面積的比例<50%計(jì)1分；(2)細(xì)胞質(zhì)和(或)核內(nèi)見較深黃色顆粒，陽性顆粒占細(xì)胞面積的比例約在51%~70% 計(jì)2分；(3)細(xì)胞質(zhì)和(或)核內(nèi)見大量深黃色顆粒，漿和(或)核可被顆粒掩蓋而不顯，陽性顆粒所占細(xì)胞面積的比例>70%計(jì)3分。每片計(jì)500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算表達(dá)率及陽性積分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間檢驗(yàn)采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMI-1蛋白在各期CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá) BMI-1蛋白陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀大多數(shù)定于細(xì)胞漿內(nèi)，見圖 1，CML-AP/BP組BMI-1蛋白表達(dá)陽性率及陽性積分均顯著高于對照組和CML-CP組(P<0.05)，CML-CP組和對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 CML細(xì)胞 BMI-1蛋白表達(dá)(S-P法染色，×1000)

表1 BMI-1蛋白在各組中表達(dá)的比較

2.2 BMI-1蛋白在CML-AP/BP患者治療后骨髓單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)的比較 BMI-1蛋白陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)顆粒狀大多數(shù)彌散于細(xì)胞胞漿內(nèi)，未緩解組BMI-1的表達(dá)顯著高于緩解組(P<0.05)。見表2。

表2 BMI-1蛋白在治療一療程緩解組及未緩解組表達(dá)的比較(±s)

表2 BMI-1蛋白在治療一療程緩解組及未緩解組表達(dá)的比較(±s)

注：與未緩解組比較，*t=3.562,P=0.0003；△t=5.431,P=0.0000。

組別 例數(shù) 陽性率(%) 積分(分)未緩解組緩解組5 11 40.78±12.58 12.98±10.11*68.24±7.22 17.63±6.29△

3 討論

1991年荷蘭癌癥中心在研究小鼠淋巴瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)了BMI1基因，后被認(rèn)為是癌基因C-myc的協(xié)同基因，屬于多梳基因PcG(Polycomb group，PcG)家族；人類BMI1基因定位于10號染色體的短臂1區(qū)3帶(10p13)，該區(qū)與惡性淋巴瘤和兒童白血病的染色體移位有關(guān)，BMI1基因與干細(xì)胞成長調(diào)控，細(xì)胞分化及惡變密切相關(guān)[3-7]。此外，BMI1基因在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的永生化和衰老方面也有著重要作用[8，9]。 其有類似于癌基因的作用[10，11]。 動物試驗(yàn)表明[12]，表達(dá)BMI1的小鼠外周血中白血病細(xì)胞的數(shù)量明顯多于BMI1缺失的小鼠，將BMI1缺失小鼠的骨髓細(xì)胞移植給受者小鼠，這些小鼠不發(fā)生急性髓系白血病，但將BMI1轉(zhuǎn)染原本BMI1缺失的小鼠骨髓細(xì)胞中，然后移植給受者小鼠，受者小鼠則可發(fā)生急性髓系白血病，說明Bmi1對白血病干細(xì)胞的增殖以及致白血病的能力具有決定性作用。研究還發(fā)現(xiàn)[13]，急性白血病病人的骨髓中BMI1的表達(dá)水平明顯高于正常人，尤其是在急性髓細(xì)胞白血病微分化型的病人骨髓中，BMI1的表達(dá)水平更高。

本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中BMI1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CMLAP/BP組BMI-1蛋白陽性率及積分遠(yuǎn)高于對照組和 CML-CP組(P<0.05)，CML-CP組則和對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示BMI1基因可能在CML急變過程中發(fā)揮了一定的作用，其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方案化療一療程未緩解組BMI-1蛋白陽性率及積分顯著高于一療程緩解組(P<0.05)，提示BMI1基因高表達(dá)與CML細(xì)胞對化療藥物的敏感性有關(guān)，其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。結(jié)果還提示BMI1基因高表達(dá)參與了CML的急性變，干預(yù)BMI1基因的表達(dá)可能為CML靶向治療提供新的思路。檢測CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中BMI1基因的表達(dá)水平可作為預(yù)后評價(jià)的一個(gè)參考指標(biāo)，對臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。

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