KiSS-1在卵巢癌免疫學(xué)診斷中的價(jià)值

李觀華，潘志雄，劉曉峰，陳雪禮，薛國(guó)輝

(九江市第一人民醫(yī)院/南昌大學(xué)附屬九江醫(yī)院，檢驗(yàn)科332000)

卵巢癌是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是死亡率最高的癌癥之一，全球范圍內(nèi)每年新發(fā)卵巢癌患者超過(guò)22萬(wàn)人次[1]，而在我國(guó)每年每10萬(wàn)人中就有5個(gè)被診斷為新發(fā)卵巢癌[2]。臨床上超過(guò)70%的患者就診時(shí)已是晚期，而早期卵巢癌患者5年生存率可達(dá)70%～90%，晚期卵巢癌患者5年生存率則僅為20%～30%[3]。卵巢癌早期診斷并及時(shí)治療，患者的存活率可高達(dá)90%[4]，因此早期及時(shí)準(zhǔn)確診斷是改善預(yù)后的關(guān)鍵問(wèn)題。病理組織檢測(cè)是診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但因早期未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，病理檢測(cè)也較為困難，因而血清學(xué)檢測(cè)成為早期研究的重點(diǎn)。

目前如CA-199、CA-125、CEA等糖類抗原已用于卵巢癌臨床診斷[5]。關(guān)于其準(zhǔn)確性和研究也有較多報(bào)道，但單獨(dú)檢測(cè)的靈敏度較低[6]，所以臨床上常使用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)[7]，并配合病理檢測(cè)來(lái)診斷，新型腫瘤標(biāo)志物的研究成為焦點(diǎn)。KiSS-1基因最先是被鑒定為黑色素瘤轉(zhuǎn)移的一種抑制基因，新近研究發(fā)現(xiàn)KiSS-1是多種癌癥中的轉(zhuǎn)移抑制因子[8]。已有大量的證據(jù)[9,10]表明KiSS-1表達(dá)下調(diào)與較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)，KiSS-1在腫瘤生物學(xué)中的作用可能是通過(guò)其與在多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)相互作用發(fā)揮抑制作用的[11]。KiSS-1基因表達(dá)缺失同樣存在于在卵巢癌中，但其應(yīng)用于臨床卵巢癌免疫學(xué)診斷則少見(jiàn)報(bào)道，我們前期研究通過(guò)克隆純化KiSS-1蛋白并免疫動(dòng)物提純出兔抗人KiSS-1抗體[12]，并利用KiSS-1抗體和KiSS-1蛋白建立ELISA法，本研究利用前期建立的ELISA法檢測(cè)卵巢癌患者血清KiSS-1蛋白水平，并結(jié)合其他糖類抗原檢測(cè)，綜合評(píng)價(jià)KiSS-1水平診斷價(jià)值，為卵巢癌早期臨床診斷提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2014年6月在本院婦科由病理確診的80例卵巢癌和卵巢良性腫瘤患者及同期體檢中心26例健康體檢者，分為以下三組進(jìn)行研究：(1)健康對(duì)照組26例：為本院體檢中心女性，各項(xiàng)功能均正常，無(wú)良性卵巢疾病史，年齡25～68歲，平均年齡42.2歲。(2)卵巢癌組62例：所有患者均為本院住院患者，經(jīng)病理等檢查確診為卵巢癌，包括漿液性腺癌28例、黏液性腺癌19例、低分化腺癌15例。年齡在30～62歲，平均46.1歲。(3)卵巢良性腫瘤組18例：經(jīng)病理確診卵巢良性腫瘤，包括子宮肌瘤8例、卵巢囊腫5例、良性畸胎瘤5例，年齡27～55歲，平均38.3歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 三組受檢人群均在清晨空腹時(shí)靜脈采血5ml，2h內(nèi)分離血清檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 糖類抗原檢測(cè)方法 運(yùn)用羅氏Combs 6000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)血清糖類抗CA-125、CA-199、CEA水平。所有檢測(cè)均按儀器及試劑說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作。 CA-125≥35U/ml、CA-199≥37 U/ml、CEA≥15μg/L判斷為陽(yáng)性，低于該界值判斷為陰性。

1.2.3 KiSS-1檢測(cè)方法 采用前期研究中得到及提純的兔抗人KiSS-1分子多克隆抗體建立KiSS-1檢測(cè)的雙抗體夾心ELISA方法，具體如下：(1)包被：用pH 9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為0.55μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。(2)加樣：加一定稀釋的待檢樣品100μl于上述已包被的反應(yīng)孔中，置37℃孵育1h。然后洗滌。同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。(3)加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入來(lái)自華美生物有限公司購(gòu)買(mǎi)的新鮮稀釋的辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度 100)，37℃孵育 0.5h，洗滌。(4)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液100μl，37℃10～30min。 (5)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸50μl。立即在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取450nm吸光度值，空白孔凋零,反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng),OD值越高，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。結(jié)果判定：樣品血清每份做2孔，取平均值判斷結(jié)果，空白孔調(diào)零，選擇7個(gè)正常血清和2個(gè)卵巢癌患者血清作為判斷每批ELISA試驗(yàn)之間可靠性的指標(biāo)；100例正常人血清OD值的平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為判斷臨界值，高于此為陽(yáng)性，低于此為陰性。ELISA檢測(cè)陰性判定為KiSS-1診斷陽(yáng)性(缺失為陽(yáng)性)，反之則為陰性。

1.3 診斷效能評(píng)價(jià)指標(biāo) 計(jì)算方法為：靈敏度=標(biāo)志物真陽(yáng)性數(shù)/(標(biāo)志物真陽(yáng)性數(shù)+標(biāo)志物假陰性數(shù))；特異性=標(biāo)志物真陰性數(shù)/(標(biāo)志物真陰性數(shù)+標(biāo)志物假陽(yáng)性數(shù))；準(zhǔn)確率=標(biāo)志物真陽(yáng)性數(shù)+標(biāo)志物真陰性數(shù)/總病例數(shù)；Youden指數(shù)(靈敏度+特異性－100%)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有計(jì)量資料的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，各組之間比較用Mann Whitney U檢驗(yàn)(非參數(shù)檢驗(yàn))。組間計(jì)數(shù)資料率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群中 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA 的診斷陽(yáng)性率比較 經(jīng)測(cè)定后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)所測(cè)4類抗原在卵巢癌組和卵巢良性腫瘤組的診斷陽(yáng)性率均顯著高于對(duì)照組和卵巢良性腫瘤中有顯著差異。其中CA-125在卵巢癌和良性腫瘤組中陽(yáng)性率為各檢測(cè)抗原中最高，敏感性最高。KiSS-1在血清中對(duì)卵巢癌組和卵巢良性腫瘤的診斷陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組 (P<0.05)，但與CA-125、CA-199標(biāo)志物相比診斷陽(yáng)性率相對(duì)較低，其敏感性與CEA相當(dāng)。KiSS-1在卵巢癌中表達(dá)陽(yáng)性率在良性卵巢癌腫瘤和卵巢癌中均有所下降。此外，可以發(fā)現(xiàn)在3例健康對(duì)照中，KiSS也出現(xiàn)診斷率陽(yáng)性情況，即表達(dá)缺失。

表1 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA在各組受檢人群中診斷陽(yáng)性率結(jié)果比較

2.2 KiSS-1與 CA-125、CA-199、CEA 在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確性及Youden指數(shù)比較在卵巢癌組患者中，CA-125的敏感性最高為79.03%，高于其他標(biāo)志物，其中KiSS-1較現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物靈敏度低為48.39%。四類標(biāo)志物特異性水平均較高，其中KiSS-1特異性達(dá)到79.55%，略低于CA-199和CEA。準(zhǔn)確性CA-125最高為79.25%，CEA和KiSS-1對(duì)卵巢癌的診斷準(zhǔn)確性比較接近。Youden指數(shù)由高到低依次為CA-125(54.03%)、CA199(44.72%)、CEA(35.70%)和 KiSS-1(27.94%)，KiSS-1 Youden指數(shù)水平較低。綜合分析，CA-125和CA-199作為單個(gè)標(biāo)志物在卵巢癌診斷中診斷性能較高；而KiSS-1與CEA診斷水平總體相當(dāng)，或可成為診斷卵巢癌的一種新型指標(biāo)。見(jiàn)表2。

2.3 KiSS-1聯(lián)合 CA-125、CA-199、CEA 在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及Youden指數(shù)的比較 CA-125作為卵巢上皮性腺癌的首先標(biāo)記物，在本研究中也體現(xiàn)出對(duì)卵巢癌診斷的優(yōu)勢(shì)，因此作為聯(lián)合診斷的必要標(biāo)志物。KiSS-1聯(lián)合CA-125及其他標(biāo)志物時(shí)，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及Youden指數(shù)均隨著指標(biāo)組合增加而升高，表明聯(lián)合檢測(cè)的診斷效果更強(qiáng)。其中KiSS-1+CA125+CA199+CEA組合對(duì)卵巢癌診斷準(zhǔn)確率高達(dá)91.25%。KiSS-1作為單個(gè)診斷因素時(shí)診斷效果顯然低于CA-125等，但與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)時(shí)大大提升了原有組合(CA125+CA199+CEA)的診斷能力。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)統(tǒng) 計(jì) KiSS-1、KiSS-1+CA-125、KiSS-1+CA125+CA199、KiSS-1+CA125+CA199+CEA 及 CA125+CA199+CEA幾組的實(shí)際數(shù)目來(lái)計(jì)算它們的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及Youden指數(shù)。聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，只要任何一項(xiàng)是陽(yáng)性即可總體判斷為陽(yáng)性；所有標(biāo)志全為陰性則判斷為總體陰性。見(jiàn)表3。

表2 KiSS-1與CA-125、CA-199、CEA在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及Youden指數(shù)的比較(%)

表3 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA聯(lián)合檢測(cè)在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性及Youden指數(shù)的比較

3 討論

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但病死率卻超過(guò)兩者之和，具有較高的病死率，主要原因是早期臨床診斷困難及治療后腫瘤易復(fù)發(fā)。卵巢癌早期無(wú)任何癥狀，較難發(fā)現(xiàn)，就醫(yī)時(shí)多為中晚期，術(shù)后五年生存率低[13]。故而早期診斷對(duì)于臨床診療意義重大。

目前卵巢癌早期只能通過(guò)血清腫瘤標(biāo)志物等篩查，血清腫瘤標(biāo)志物在臨床腫瘤疾病的診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等方面有著重要意義[14]。但由于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)具有復(fù)雜和多樣性的特性，相同類型的腫瘤可產(chǎn)生一種或多種腫瘤標(biāo)志物，而不同腫瘤或同一腫瘤的不同組織類型既可以產(chǎn)生相同的腫瘤標(biāo)志物，也可以產(chǎn)生不同的腫瘤標(biāo)志物，所以絕大部分單一的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的敏感性或特異性偏低，不能達(dá)到臨床診療的需要，尤其是卵巢癌的早期診斷，血清CA-125在卵巢癌診斷中的特異性一直較好，但由于CA-125主要表達(dá)于漿液性卵巢癌，并且其水平高低與卵巢癌的臨床分期密切相關(guān)，中、晚期卵巢癌患者血清中CA-125檢測(cè)的水平和陽(yáng)性率較高，而早期患者CA-125水平和陽(yáng)性率不高[15]。因此，針對(duì)不同類型的腫瘤，組合不同的標(biāo)志物進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)腫瘤的及早治療極為重要。目前臨床對(duì)卵巢癌診斷主要聯(lián)合檢測(cè)指標(biāo)有CA-125、CA-199、CEA等，但診斷準(zhǔn)確性有待提高，亟需新型標(biāo)志物參與聯(lián)合檢測(cè)以提高診斷能力。本研究選用KiSS-1作為新型指標(biāo)，并聯(lián)合 CA125、CA199、CEA聯(lián)合檢測(cè)，探討單個(gè)及聯(lián)合檢測(cè)模式在卵巢癌篩查和早期診斷中的臨床價(jià)值。KiSS-1表達(dá)缺失常見(jiàn)于多種腫瘤中，如卵巢癌，但目前對(duì)KiSS-1作為癌癥診斷標(biāo)志物的研究則鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)研究卵巢癌患者血清KiSS-1水平，并評(píng)價(jià)其診斷性能，判定其在早期卵巢癌診斷中的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KiSS-1單獨(dú)檢測(cè)時(shí)特異性和靈敏度均不是很高，與CEA診斷效果相當(dāng)，但當(dāng)其與CA125、CA199、CEA聯(lián)合檢測(cè)時(shí)則可以顯著提高診斷準(zhǔn)確性，這表明聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于卵巢癌診斷優(yōu)勢(shì)明顯，這與美國(guó)學(xué)者的研究結(jié)果相符[16]。當(dāng)KiSS-1加入原有檢測(cè)組合CA125+CA199+CEA時(shí)，可顯著提升診斷準(zhǔn)確性近10%，因而KiSS-1或可成為卵巢癌診斷的新型標(biāo)志物。

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