LZTFL1、Integrinβ1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

鄭月娥，李里香

(1、江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)部，江西 南昌 330201；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006)

原發(fā)性肝癌90%以上是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)。肝細(xì)胞癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肝細(xì)胞癌年發(fā)病率和年死亡率均居惡性腫瘤的第二位，僅次于肺癌[1]。目前，治療肝細(xì)胞癌公認(rèn)的最有效方法是手術(shù)切除。但即使行根治性切除術(shù)，5年內(nèi)仍有60%～70%的患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[2]。肝細(xì)胞癌侵襲力強(qiáng)，早期即可發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，這也是肝細(xì)胞癌死亡率高的主要原因。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的涉及多步驟多因素參與的主動(dòng)過(guò)程。抑癌基因常能夠在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟中發(fā)揮抑制作用[3]。LZTFL1是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)LZTFL1能與細(xì)胞骨架Actin結(jié)合，能夠成為黏附連接蛋白復(fù)合物(FAP)的一個(gè)組成部分[4]。而FAP是黏附分子Integrinβ1發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年，大量國(guó)內(nèi)外的研究表明Integrinβ1的表達(dá)與肝癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及腫瘤的分化、分級(jí)、預(yù)后等密切相關(guān)，尤其在肝癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[5-7]。兩者在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及是否與肝癌患者臨床病理特征有關(guān)，目前尚未見(jiàn)明確的報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織中LZTFL1和Integrinβ1的表達(dá)，探討二者在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象及標(biāo)本來(lái)源 收集90例HCC石蠟標(biāo)本(男 75例，女15例)，年齡 24~74歲，平均 51歲。 其中高分化癌30例，中分化癌30例，低分化癌30例，均為2009年1月至2012年12月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診的外科手術(shù)標(biāo)本，術(shù)前均未行放療/化療。20例正常肝組織標(biāo)本來(lái)自本院因肝海綿狀血管瘤手術(shù)的標(biāo)本。

1.2 試劑與方法 兔抗人LZTFL1單克隆抗體(ab57395)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，鼠抗人Integrinβ1單克隆抗體(D2E5)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，廣譜二抗試劑盒、免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。4μm連續(xù)切片，每例撈3張玻片，分別進(jìn)行HE染色和LZTFL1、Integrinβ1免疫組織化學(xué)染色 (操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。LZTFL1一抗稀釋液濃度為1:100，Integrinβ1一抗稀釋液濃度為1:80。組織抗原修復(fù)采用高溫高壓修復(fù)處理，抗原修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液。

1.3 結(jié)果判定 LZTFL1蛋白免疫組化結(jié)果以胞質(zhì)中棕色顆粒沉積為陽(yáng)性；Integrinβ1蛋白免疫組化結(jié)果以胞膜上棕色顆粒沉積為陽(yáng)性。切片由兩位觀察者評(píng)判，連續(xù)計(jì)數(shù) 5個(gè)高倍視野，按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]，視野中腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分率：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為 0分，≤10%為1分，11~50%為 2分，51~75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度：腫瘤細(xì)胞無(wú)特異著色為0分，呈淺黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕黑色為3分；以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分與染色強(qiáng)度得分的乘積作為總評(píng)分。按照總評(píng)分將結(jié)果分為：0分為陰性(-)，1~4分為弱陽(yáng)性(+)，4~8分為中等陽(yáng)性(++)，9~12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。在統(tǒng)計(jì)分析中以≤4分為低表達(dá)；＞4分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 免疫組化結(jié)果用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，取α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件)。

2 結(jié)果

2.1 LZTFL1、Integrinβ1蛋白在肝細(xì)胞癌組織及正常肝組織中的表達(dá) LZTFL1在正常肝組織細(xì)胞胞漿大多呈棕褐色著色，表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性；肝細(xì)胞癌組織細(xì)胞胞漿多呈淡黃色著色，表達(dá)呈弱陽(yáng)性；與正常肝組織相比，肝細(xì)胞癌組織中LZTFL1陽(yáng)性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。而Integrinβ1在正常肝組織細(xì)胞胞膜多數(shù)無(wú)特異性著色，肝細(xì)胞癌組織細(xì)胞胞膜多呈淡黃色或棕色著色；與正常肝組織相比，肝細(xì)胞癌組織中Integrinβ1陽(yáng)性率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 LZTFL1、Integrinβ1在正常肝組織及肝癌組織中的表達(dá)情況(n，%)

圖1 LZTFL1、Integrinβ1蛋白在正常肝組織和HCC組織中的免疫組化SP染色 ×200

2.2 LZTFL1、Integrinβ1蛋白表達(dá)與 HCC臨床病理學(xué)特征參數(shù)的關(guān)系 LZTFL1的陽(yáng)性表達(dá)率隨著肝細(xì)胞癌組織分化程度的降低而逐漸下降，表達(dá)強(qiáng)度高分化組顯著高于中分化組和低分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Integrinβ1的陽(yáng)性表達(dá)率隨著肝細(xì)胞癌組織的分化程度的降低逐漸升高，表達(dá)強(qiáng)度高分化組顯著低于低分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022＜0.05)。此外，二者的表達(dá)與患者的年齡、性別無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。分別見(jiàn)表2、表 3。

2.3 LZTFL1和Integrinβ1表達(dá)的相關(guān)性 HCC組織中 LZTFL1和 Integrinβ1呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān) (r=-0.406，P=0.026＜0.05)。 見(jiàn)表 4。

表2 HCC中LZTFL1的表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理學(xué)特征參數(shù)的關(guān)系

表3 HCC中Integrinβ1的表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理學(xué)特征參數(shù)的關(guān)系

表4 HCC中LZTFL1和Integrinβ1表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析

3 討論

LZTFL1(Leucine Zipper Transcription Factor Like 1)是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子[4]，位于人類3號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶第3亞帶(3p21.3)末端盧卡區(qū)約5Mb處。2001年Kiss[9]等人在對(duì)人類染色體3p21.3的C3CER1區(qū)域進(jìn)行基因組測(cè)序中首次發(fā)現(xiàn)并克隆了LZTFL1基因。2010年，魏群[4]等對(duì)組織芯片及84例胃癌患者進(jìn)行了研究，這一研究首次證實(shí)了LZTFL1是腫瘤抑制因子，在多種腫瘤組織中低表達(dá)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)LZTFL1能與細(xì)胞骨架Actin結(jié)合[4]，能夠成為黏附連接蛋白復(fù)合物(FAP)的一個(gè)組成部分。隨后，國(guó)外學(xué)者Sakurai T[10]等對(duì)SAMP8老鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明LZTFL1能促進(jìn)中樞神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，可能參與了運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)海馬區(qū)認(rèn)知損害的預(yù)防作用。Seo S[11]等發(fā)現(xiàn)LZTFL1是巴-比二氏綜合征蛋白復(fù)合物睫毛運(yùn)輸作用及Hedgehog信號(hào)的重要調(diào)節(jié)因子，且Marion V[12]等進(jìn)一步研究證實(shí)LZTFL1是一種新的巴-比二氏綜合征相關(guān)基因。

Integrinβ1是構(gòu)成細(xì)胞與細(xì)胞、及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間不可缺少的黏附因子。FAP是整合素信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。FAP的形成和焦點(diǎn)粘著斑激酶(FAK)的激活使整合素可通過(guò)多種特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[14-16]。大量國(guó)內(nèi)外的研究表明Integrinβ1的表達(dá)與肝癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及腫瘤的分化、分級(jí)、預(yù)后等密切相關(guān)。由于正常成人肝細(xì)胞不存在基膜，所以肝細(xì)胞中整合素的表達(dá)與其他上皮細(xì)胞有所不同，僅能低水平的表達(dá)幾種整合素；當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，整合素受體隨之發(fā)生改變，其中表達(dá)明顯升高的整合素中以β1亞基的作用最為重要[5]。Integrinβ1不僅是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的主要的黏附分子，也是腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附的主要的黏附分子。在肝癌細(xì)胞的黏附轉(zhuǎn)移中整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著非常重要的作用。Musumoto[6]等研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的侵襲性可被Integrinβ1的單克隆抗體TS2/16所抑制，Integrin β1與肝癌的侵襲潛能相關(guān)；同時(shí)，郭悅青[7]等研究也表明肝癌組織內(nèi)Integrinβ1的表達(dá)明顯高于非肝癌組織，且在肝癌中Integrinβ1的表達(dá)可作為判斷肝癌侵襲性的一項(xiàng)指標(biāo)。因此，Integrinβ1的表達(dá)在肝癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

為了進(jìn)一步研究LZTFL1的生物學(xué)功能，我們用免疫組織化學(xué)SP法聯(lián)合檢測(cè)了90例HCC組織及20例正常組織中LZTFL1及Integrinβ1的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，HCC組織中LZTFL1的表達(dá)顯著降低，隨著HCC分化程度的降低，LZTFL1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸下降，且中、低分化組中LZTFL1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于高分化組；而In-Integrinβ1在HCC組織中的表達(dá)明顯升高，并隨著分化程度的降低，Integrinβ1的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，低分化組明顯高于與高分化組的表達(dá)強(qiáng)度；差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。二者在不同年齡和性別的HCC患者中的表達(dá)均無(wú)顯著性差異。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LZTFL1表達(dá)的降低及Integrinβ1表達(dá)的升高與HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示LZTFL1高表達(dá)可能能夠抑制肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移。我們的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)90例HCC組織中LZTFL1和Integrinβ1的蛋白表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)(r=-0.406，P=0.026＜0.05)。 提示 LZTFL1 可能通過(guò)結(jié)合細(xì)胞骨架Actin作為細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架黏附物的一個(gè)組成部分，調(diào)控Integrinβ1，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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