逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞裸鼠荷瘤能力的抑制作用研究

齊澤華，韓 濤，劉軍靈，郭 放，馬東初，韓雅玲，劉兆喆，謝曉冬

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中醫(yī)藥研究

·論著·

逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞裸鼠荷瘤能力的抑制作用研究

齊澤華，韓 濤*，劉軍靈，郭 放，馬東初，韓雅玲，劉兆喆，謝曉冬

目的 比較逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑與單藥順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞成瘤能力的影響及并分析逍遙簍貝散是否能減少順鉑的不良反應(yīng)，期望為臨床應(yīng)用中藥逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑治療乳腺癌提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 建立乳腺癌細(xì)胞系MCF-7荷瘤小鼠模型，將12只裸鼠隨機(jī)分成3組，每組4只。以腫瘤生長(zhǎng)情況和抑瘤率為指標(biāo)，觀察各組藥物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用；以小鼠的一般情況、血清肌酐、尿素氮為指標(biāo)，觀察聯(lián)合用藥是否能減少順鉑治療的不良反應(yīng)。結(jié)果 逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組與單藥順鉑組對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7成瘤能力均有不同程度的抑制作用，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組和單藥順鉑組腫瘤體積較對(duì)照組顯著減少(P<0.01)，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組荷瘤小鼠一般情況好于單藥順鉑組，并且肌酐、尿素氮水平低于單藥順鉑組(P<0.05)。結(jié)論 逍遙簍貝散具有抗腫瘤作用，與順鉑聯(lián)合使用，在增加抑瘤作用的同時(shí)，可一定程度減少順鉑的不良反應(yīng)。

逍遙簍貝散；順鉑；乳腺腫瘤；大鼠,裸

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，占女性全部惡性腫瘤的22%，是危害女性健康的重要疾病[1]。乳腺癌曾在中國等發(fā)展中國家低發(fā)，然而隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)環(huán)境等諸多因素的發(fā)展，乳腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加，僅僅10年時(shí)間乳腺癌的總體發(fā)病率提高了10倍[2]，在中國乳腺癌更以每年2.7%的比例快速增長(zhǎng)[3]。目前乳腺癌的治療仍然以手術(shù)切除為主，并且術(shù)后輔助化療及內(nèi)分泌治療也成為乳腺癌的重要治療方法，但作為我國千年傳承的中醫(yī)中藥在乳腺癌治療中的作用往往為人們所忽視，越來越多的證據(jù)提示，中醫(yī)藥治療可以顯著改善乳腺癌的治療效果，極大改善乳腺癌患者的進(jìn)展及預(yù)后，為乳腺癌患者的治療提供了新的選擇[4-5]。

順鉑是較常用的一種化療藥物，具有抗癌譜廣、作用強(qiáng)、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用且無交叉耐藥等特點(diǎn)，為當(dāng)前聯(lián)合化療中常用的藥物之一，常用于晚期乳腺癌的治療[6]，但是乳腺癌對(duì)順鉑為主的化療具有相對(duì)不敏感性，且治療后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良[6]。逍遙簍貝散具有疏肝健脾，行氣散結(jié)的雙重功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，中藥逍遙簍貝散中的特定組分能促進(jìn)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有一定促進(jìn)作用[7]，且與某些化療藥聯(lián)合應(yīng)用，在療效上顯現(xiàn)協(xié)同作用，并能減輕化療藥的不良反應(yīng)，有重要的抗腫瘤活性[8-9]。目前，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的抑制作用報(bào)道較少，本研究擬比較逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑與單藥應(yīng)用順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞成瘤能力的抑制作用，并分析逍遙簍貝散是否能減少順鉑的毒副作用，期望為臨床應(yīng)用中藥逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 清潔級(jí)裸鼠12只，體重20～30 g，6周齡，購于上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)為本實(shí)驗(yàn)室自備。逍遙簍貝散散劑(購自沈陽中醫(yī)院藥局)，組分：柴胡、當(dāng)歸、白芍、茯苓、貝母、法半夏、制南星各10 g,生牡蠣30 g,白術(shù)12 g,瓜蔞、山慈菇各15 g；注射用順鉑凍干型(齊魯制藥有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)：含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，種植于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，0.5%胰蛋白酶消化，用生理鹽水重懸后800 rpm離心除去胰酶，用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞2×105個(gè)，用100 μl生理鹽水混勻于Ep管中，吹打至單細(xì)胞懸液，備裸鼠荷瘤用。

1.2.2 MCF-7荷瘤小鼠模型的制備：將小鼠逐只稱重記錄并隨機(jī)分為逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組、順鉑單藥組、對(duì)照組3組，每組各4只。無菌條件下，在每只小鼠右后肢皮下注射已經(jīng)準(zhǔn)備好的乳腺癌單細(xì)胞懸液2×105個(gè)，制作裸鼠皮下荷瘤模型。

1.2.3 給藥：接種第3天開始給藥。對(duì)照組給予生理鹽水100 μl/次瘤周注射，隔日1次；順鉑組給予順鉑2 mg/(kg·次)瘤周注射，隔日1次；順鉑聯(lián)合逍遙簍貝散組除給予順鉑2 mg/(kg·次)隔日瘤周注射外，同時(shí)給予逍遙簍貝散按50 mg/(kg·次)劑量灌胃，隔日1次；共給藥21 d后停藥，繼續(xù)觀察至第8周。期間常規(guī)飼養(yǎng)，每日觀察荷瘤小鼠活動(dòng)能力、進(jìn)食及瘤體變化情況。

1.2.4 腫瘤體積測(cè)量：每周測(cè)量腫瘤直徑(d)，至第8周對(duì)荷瘤小鼠行脫臼處死，計(jì)算小鼠荷瘤體積(V=1/2d3)。抑瘤率=對(duì)照組腫瘤體積-用藥組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積。

1.2.5 肌酐、尿素氮水平測(cè)定：處死荷瘤小鼠時(shí)摘取眼球采血，室溫靜置2 h左右后，3000 r/min，5min離心取上層血清。送檢驗(yàn)科分別測(cè)定尿素氮、肌酐水平。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠腫瘤體積和抑瘤率 逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組、順鉑單藥組和對(duì)照組荷瘤小鼠腫瘤體積分別為(0.249±0.157)、(0.469±0.142)、(1.266±0.361)cm3，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組及順鉑單藥組腫瘤體積均較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組腫瘤體積較順鉑單藥組減少(P<0.05)；逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組、順鉑單藥組抑瘤率分別為(59.84±17.59)%和(76.89±17.51)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 荷瘤小鼠一般情況、肌酐、尿素氮水平 實(shí)驗(yàn)過程中觀察荷瘤小鼠，對(duì)照組無裸鼠死亡，但隨著瘤體增大活動(dòng)量逐漸減少且消瘦，毛色晦暗干枯。順鉑單藥組裸鼠用藥開始時(shí)活動(dòng)明顯減少，消瘦較為明顯，毛色干枯，但瘤體增長(zhǎng)較慢，至第3周時(shí)死亡1只裸鼠，治療后期(第6周～第8周)剩余3只裸鼠狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，活動(dòng)量增加，瘤體增長(zhǎng)較慢。逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組小鼠一般情況好于上述兩組，無裸鼠死亡，活動(dòng)能力較上述兩組改善，略有消瘦，瘤體增長(zhǎng)緩慢。

逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組、順鉑單藥組和對(duì)照組荷瘤小鼠肌酐水平分別為(60.448±2.752)、(72.303±3.475)、(25.986±0.789)mmol/L，尿素氮分別為(9.862±0.634)、(13.66±2.333)、(6.438±0.171)mmol/L，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組和單藥順鉑組的肌酐、尿素氮水平均高于對(duì)照組，但逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組肌酐、尿素氮水平低于單藥順鉑組(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素參與并相互作用的結(jié)果，涉及環(huán)境、飲食、生育和激素失衡等諸多原因，而相關(guān)資料顯示，遺傳易感性和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的失調(diào)及紊亂在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用[10-14]。傳統(tǒng)的乳腺癌治療手段以手術(shù)切除為主，術(shù)后的輔助化療及內(nèi)分泌治療也成為乳腺癌的重要治療方法，這些方法使早期乳腺癌的治療取得了較好的療效，但對(duì)于晚期乳腺癌的療效并不理想，近些年來隨著抗癌藥物的不斷研發(fā)，晚期乳腺癌患者多采用多藥聯(lián)合、不同途徑給藥等化學(xué)治療方法，以期患者生存期有所延長(zhǎng)，但同時(shí)，多藥聯(lián)合化療嚴(yán)重不良反應(yīng)也在一定程度上影響著患者的生活質(zhì)量，因此找到一種既可以調(diào)控機(jī)體整體免疫狀態(tài)，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，又可以協(xié)同化療藥物抑瘤作用，減輕化療藥物不良反應(yīng)的輔助藥物成為研究人員所亟須解決的難題。隨著循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展，作為我國千年傳承的中醫(yī)中藥在乳腺癌治療中逐漸進(jìn)入人們的視野，越來越多的證據(jù)表明，強(qiáng)調(diào)整體辨證論治的中醫(yī)藥療法可以顯著改善乳腺癌的治療效果，極大改善乳腺癌患者的不良反應(yīng)，提高乳腺癌患者的生活質(zhì)量，為乳腺癌患者治療方式提供了新的選擇[15]。

中醫(yī)對(duì)乳腺癌病機(jī)的認(rèn)識(shí)多歸結(jié)于肝氣郁結(jié)，脾失健運(yùn)，乳房為陽明經(jīng)所司，乳頭為厥陰經(jīng)肝所屬，若平素性情不暢肝失調(diào)達(dá)，郁久則氣血瘀滯，糾結(jié)日久，積聚于乳房可發(fā)為乳腺癌[16]，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所認(rèn)為的乳腺癌是一種全身性疾病不謀而合。而中醫(yī)藥治療乳腺癌又有著悠久歷史，其所強(qiáng)調(diào)的“整體觀念，辨證論治”的疏肝解郁法始終貫穿于乳腺癌整個(gè)治療進(jìn)程中[17]。中藥逍遙簍貝散最早見于《太平惠民和劑局方》，主治肝郁痰凝之乳癖、乳巖、瘰疬等證。具有疏肝健脾，行氣散結(jié)的雙重功效，其方中主要成分為柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓，甘草[18-19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，柴胡、當(dāng)歸、白芍疏肝解郁，養(yǎng)血柔肝；白術(shù)、茯苓、甘草補(bǔ)脾益腎，燥濕和中?，F(xiàn)代藥理研究亦證實(shí)，白芍能促進(jìn)淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞免疫及體液免疫均有一定促進(jìn)作用，白術(shù)降低癌細(xì)胞的增值率，減低瘤組織的侵襲性，提高機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)能力及對(duì)抗瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。當(dāng)歸多糖與某些化療藥聯(lián)合應(yīng)用，在療效上顯現(xiàn)協(xié)同作用，并能減輕化療藥的副作用，有重要的抗腫瘤活性。茯苓多糖激活局部補(bǔ)體使腫瘤臨近區(qū)域被激活的補(bǔ)體通過影響巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或其他細(xì)胞及體液因子，從而協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，為1種可增強(qiáng)人體免疫功能的多糖物質(zhì)[20]。柴胡多糖能提高小鼠體液和細(xì)胞免疫功能，并使免疫抑制狀態(tài)有一定程度的恢復(fù)，有幫助腫瘤患者恢復(fù)食欲的功效。諸藥合用，具有疏肝健脾，行氣散結(jié)功效。然而作為中華瑰寶的中藥逍遙簍貝散在現(xiàn)代腫瘤治療中卻往往為人所忽視，本研究聚焦于中藥逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌荷瘤小鼠的體內(nèi)抑瘤效果研究，具有一定的創(chuàng)新性和臨床轉(zhuǎn)化研究?jī)r(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以荷瘤裸鼠為動(dòng)物模型，首先觀察了順鉑單藥、逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7成瘤能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組及順鉑單藥組腫瘤體積均較對(duì)照組明顯減少，表明逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組和順鉑單藥組成瘤能力明顯低于對(duì)照組。逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組腫瘤體積低于順鉑單藥組，逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組和順鉑單藥組的抑瘤率均>30%，說明兩組均具有一定抗腫瘤作用，且逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組應(yīng)用效果要好于單用順鉑組。其次，實(shí)驗(yàn)中可以觀察到，順鉑組荷瘤裸鼠給藥過程中逐漸出現(xiàn)活動(dòng)能力降低等與順鉑治療的不良反應(yīng)有關(guān)的表現(xiàn)，而逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組裸鼠一般情況要好于順鉑單藥組，檢測(cè)逍遙簍貝散聯(lián)合順鉑組肌酐、尿素氮水平均低于順鉑單藥組，說明聯(lián)合用藥可適當(dāng)減少順鉑治療產(chǎn)生的不良反應(yīng)。這一定程度上提示逍遙簍貝散聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌可增加化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)，減輕化療相關(guān)不良反應(yīng)，提高腫瘤患者生活質(zhì)量，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，通過本研究，從實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了作為傳統(tǒng)中醫(yī)中藥瑰寶的逍遙簍貝散方劑對(duì)化療藥物的增效作用，其主要表現(xiàn)在提高腫瘤的緩解率及改善臨床癥狀，降低化療藥物毒性反應(yīng)，從而使化療可按時(shí)、按劑量、按階段進(jìn)行，達(dá)到增加治療目的，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期的效果，這也為抗腫瘤新藥的開發(fā)和臨床腫瘤治療提供了新的思路和相關(guān)理論依據(jù)，具有積極的意義。

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Inhibition Effect of Xiaoyaoloubei Powder in Combination of Cisplatin on Tumor Formation of Breast Cancer Cells in Nude Mice

QI Ze-hua1,2a, HAN Tao2a, LIU Jun-ling2a, GUO Fang2a, MA Dong-chu2b, HAN Ya-ling2c, LIU Zhao-zhe2a, XIE Xiao-dong2a

(1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110000, China; a. Department of Oncology, b. Department of Medical Experiments, c. Department of Cardiology, 2. General Hospital of Shenyang Military Area Command, Shenyang 110840, China)

Objective To compare the effect between Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and single Cisplatin on anti-cancer therapy, and to analyze whether Xiaoyaoloubei powder can reduce the adverse effects of Cisplatin or not so as to provide basic experiment support for Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin in clinical treatment of breast cancer. Methods Tumor-bearing nude mice models of breast cancer cell line MCF-7 were established, and the 12 nude mice were randomly divided into control group (n=4), Cisplatin group (n=4) and Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin group (n=4). The inhibition effects on tumor formation were observed in all groups according to tumor growth and the inhibitory rate as anti-cancer evaluation criterion; the question of whether combined administration could reduce the adverse effects of Cisplatin treatment was also observed according to the general situation of mice, serum creatinine and urea nitrogen as evaluation criterion. Results Both Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and single Cisplatin have inhibitory effects on tumor formation of breast cancer cell line MCF-7 in different degrees, and the tumor sizes in Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin and Cisplatin groups were significantly reduced compared with that in control group (P<0.01); the general status in Xiaoyaoloubei powder in combination of Cisplatin group was better than that in Cisplatin group, and the levels of creatinine and urea nitrogen in combined group were decreased compared with those in Cisplatin group (P<0.05). Conclusion Xiaoyaoloubei powder has anti-cancer effect, and in combination of Cisplatin can reduce the adverse reactions of Cisplatin to a certain extent as well as increase the ability of anti-cancer effect.

Xiaoyaoloubei powder; Cisplatin; Breast Neoplasms; Rats, nude

科技部十二五重大新藥創(chuàng)制平臺(tái)(2012ZX09303016-002)；2012年遼寧省科技攻關(guān)計(jì)劃(2012225019)

110000 沈陽,遼寧中醫(yī)藥大學(xué)(齊澤華)；110840 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科(齊澤華、韓濤、劉軍靈、郭放、劉兆喆、謝曉冬)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科(馬東初)，心內(nèi)科(韓雅玲)

謝曉冬,E-mail：doctor_xxd@163.com；劉兆喆，E-mail：lzz_summer@126.com

R-332

A

2095-140X(2015)03-0090-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.022

2014-11-17 修回時(shí)間：2015-01-20)

*為共同第一作者