阿司匹林與硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤細胞中相互作用的實驗探討

丁江華，袁利亞，陳國安

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·論著·

阿司匹林與硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤細胞中相互作用的實驗探討

丁江華，袁利亞，陳國安

目的 探討阿司匹林(ASA)聯(lián)合硼替佐米(BTZ)在多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞中的相互作用及分子機制。方法 以MM1.S與RPMI-8226細胞為研究對象，觀察ASA、BTZ及ASA聯(lián)合BTZ對MM細胞增殖與凋亡的影響，分析二者相互作用，并檢測對Bcl-2、總Akt蛋白與磷酸化蛋白表達的影響。結果 在24～72 h內，ASA組和BTZ組的細胞增殖抑制率均低于ASA+BTZ組(P<0.05)，藥物相互作用分析顯示：二者存在相加作用；在藥物處理48 h后，ASA組和BTZ組細胞凋亡率均低于ASA+BTZ組(P<0.05)；藥物干預48 h后，ASA和BTZ組均下調Bcl-2蛋白表達，ASA+BTZ組則顯著抑制Bcl-2蛋白水平(P<0.01，P<0.05)；藥物干預48 h后，ASA組抑制p-Akt(Thr308)與 p-Akt(Ser473)蛋白表達(P<0.05)，BTZ組上調p-Akt(Thr308)蛋白表達水平(P<0.05)，而ASA+BTZ組則明顯抑制p-Akt(Thr308)與 p-Akt(Ser473)蛋白表達(P<0.05)，但對總Akt水平無影響(P>0.05)。結論 ASA具有增強BTZ的抗MM作用，其機制可能為通過下調Bcl-2表達與抑制BTZ誘導的Akt磷酸化。

多發(fā)性骨髓瘤；阿司匹林；硼替佐米；藥物相互作用

近10年來，由于新藥特別是硼替佐米(bortezomib, BTZ)的應用，多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的臨床療效得到了極大的改善。BTZ作為核心藥物，被推薦用于MM的誘導、鞏固、補救或維持治療[1]。然而，BTZ同樣存在原發(fā)與繼發(fā)性耐藥問題[2]。因此，研究如何克服BTZ耐藥，增強BTZ對MM細胞抗腫瘤作用，成為亟待解決的重要課題。我們在前期研究中已證實：阿司匹林(aspirin, ASA)在MM中具有抗腫瘤效應[3]。在本研究中，我們對ASA與BTZ在MM中的相互作用和ASA對BTZ在MM中的化療增敏作用及機制進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(雙抗)、胎牛血清(FBS)等購自美國Gibco公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁化學研究所，Annexin V-FITC 凋亡試劑購自美國BD Biosciences公司。磷酸化蛋白提取試驗購自德國Merck Millipore公司。Anti-GADPH抗體購自杭州賢至生物公司，Anti-Bcl-2抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、總Akt抗體購自美國Cell Singaling Technology公司，二抗(羊抗兔)購自美國EarthOx公司。

1.2 實驗藥物 阿司匹林粉末購自美國Sigma-Aldrich公司，以10 mol/L NaOH溶解，調整pH=7.0[4]。再以PBS稀釋到50 mmol/L作為儲存母液，用0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于4℃。

硼替佐米粉末購自美國Selleckchem公司。在5 mg硼替佐米安瓿中加入400 μl二甲基亞砜，輕輕混勻至完全溶解，再加入PBS 4600 μl，即配制成終體積5 ml的溶液，以0.22 μm濾膜過濾除菌，濃度為260 μmol/L(即1 mg/ml)，再以PBS稀釋至50 nmol/L作為儲存母液，-20℃避光保存。

1.3 細胞培養(yǎng) MM1.S細胞株由中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院邱錄貴教授惠贈；骨髓地塞米松耐藥(RMPI-8226)細胞株由浙江大學附屬第二醫(yī)院血液科趙小英教授惠贈。MM1.S與RPMI-8226細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS、青霉素與鏈霉素組成的完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。所有實驗均取對數(shù)生長期細胞。

1.4 實驗分組 由于慢性炎癥疾病患者服用常規(guī)ASA后，其體內血清ASA濃度為1～3 mmol/L[5]。我們的前述實驗顯示：2.5 mmol/L ASA在48 h內對MM1.S與RPMI-8226細胞的增殖抑制率約為50%[3]。因此，選擇2.5 mmol/L ASA作為藥物聯(lián)合的實驗濃度。由于標準劑量(1.3 mg/m2)硼替佐米在人體內的血藥濃度可在333 nmol/L高峰持續(xù)1 h，隨后進入10 nmol/L持續(xù)47 h的平臺期[6]。因此，我們選擇10 nmol/L作為BTZ藥物聯(lián)合的實驗濃度。根據所加的藥物不同，分成4組：對照組、ASA組、BTZ組、ASA+BTZ組，對照組不給予任何藥物。

1.5 實驗方法

1.5.1 CCK-8法檢測細胞增殖：收集細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml。取1×104個接種于96孔板中，分別加入上述各組藥物，終體積為200 μl/孔，另設僅加RPMI-1640培養(yǎng)液(200 μl/孔)的空白孔作為空白組，置于37℃培養(yǎng)箱分別孵育24 h、48 h與72 h。在預設時間到達時，向各孔加20 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，酶標儀檢測OD450值。細胞增殖率(Survival)=(藥物作用組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%，增殖抑制率=1-survival。

根據參考文獻[7]，兩藥物相互作用分析方法如下：R=survival(ASA+BTZ)/[survival(ASA)×survival(BTZ)]。R<0.8，表示二者具有協(xié)同作用；0.81.2表示二者具有拮抗作用。

1.5.2 Annexin V-FITC檢測細胞凋亡率：收集處理48 h后的各組細胞，用PBS洗滌2次，用1×Annexin V結合緩沖液重懸細胞，調整濃度為1×106個/ml。取各組細胞(1×105)加入待測管中，分別加入5 μl AnnexinV-FITC 及5 μl PI染液，輕微吹打重懸，避光孵育15 min，再加400 μl 1×Annexin V結合緩沖液，1 h內流式細胞儀檢測。

1.5.3 蛋白質印跡(Western blot)檢測p-Akt、總Akt與Bcl-2的蛋白表達:首先提取處理48 h后的各組細胞的總蛋白與磷酸化蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移到硝基纖維素濾膜上，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人單克隆抗體GADPH(1：1000)、Bcl-2(1：500)、p-Akt(Thr308)(1：1000)、p-Akt(Ser473)(1：1000)與總Akt(1：1000)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1：10 000)，放入ChemiDocTM XRS+System(Bio-Rad)中進行顯影并攝像。以GADPH作為內參照，利用Gel-Pro Aanalyzer軟件計算目的蛋白的積分光密度值(IOD)。

2 結果

2.1 細胞增殖活性測定 在MM1.S細胞或RPMI-8226細胞中，在24～72 h內3組中兩種細胞的增殖抑制率作用呈時間依賴性，ASA組和BTZ組的細胞增殖抑制率均低于ASA+BTZ組(P<0.05)，見表1、2。藥物相互作用分析顯示：R值均為0.8～1.2之間，提示二者存在相加作用，即ASA具有增強BTZ抗骨髓瘤細胞增殖的作用。

表1 3組MM1.S細胞的增殖抑制率比較

注：ASA為阿司匹林，BTZ為硼替佐米；與ASA+BTZ組比較，aP<0.05

表2 3組PMI-8226細胞的增殖抑制率比較

注：ASA為阿司匹林；BTZ為硼替佐米；與ASA+BTZ組比較，aP<0.05

2.2 細胞凋亡測定 在藥物處理48 h后的MM1.S細胞中，ASA組、BTZ組、ASA+BTZ組和對照組的MM細胞凋亡率分別為(45.21±2.53)%、(45.37±2.16)%、(64.27±2.93)%、(1.90±0.16)%，在RPMI-8226細胞中MM細胞凋亡率分別為(37.89±2.19)%、(57.97±2.65)%、(77.20±2.05)%、(2.58±0.59)%。在MM1.S細胞和RPMI-8226細胞中，ASA組和BTZ組細胞凋亡率均低于ASA+BTZ組(P<0.05),ASA組、BTZ組和ASA+BTZ組細胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.01)。

2.3 B細胞白血病/淋巴瘤(Bcl)-2蛋白、p-Akt與總Akt蛋白表達 在MM1.S或RPMI-8226細胞中，藥物干預48 h后ASA、BTZ、ASA+BTZ組Bcl-2、p-Akt(Ser473)蛋白表達水平均低于對照組(P<0.05，P<0.01)。與對照組比較，ASA、ASA+BTZ組p-Akt(Thr308)蛋白表達水平降低(P<0.01)，BTZ組p-Akt(Thr308)蛋白表達水平升高(P<0.05)，ASA組、BTZ組、ASA+BTZ組間p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1、2，4組間總Akt蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 4組MM骨髓瘤細胞Bcl-2、p-Akt與總Akt表達水平比較

注：ASA為阿司匹林；BTZ為硼替佐米；Bcl-2蛋白為B細胞白血病/淋巴瘤(Bcl)-2蛋白；與對照組比較，aP<0.05；bP<0.01；與ASA組比較，dP<0.01；與BTZ組比較，fP<0.01

3 討論

人口老齡化的加劇導致MM發(fā)病率逐年上升，在血液腫瘤中居第2位。最新流行病學數(shù)據顯示，MM 5年生存率已提高到45%[8-15]。其中，作為首個蛋白酶體抑制劑，BTZ在MM治療中的地位極為重要，目前已被美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)與中國版NCCN指南推薦用于MM的一線、二線及維持治療[1]。然而，BTZ也無法根治MM，主要歸因于BTZ也存在耐藥現(xiàn)象[2]。盡管不斷有臨床試驗探討增強BTZ的抗MM作用，可惜的是均為Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[16-17]，距臨床應用尚需更多的臨床試驗來驗證。ASA作為血栓預防藥物，常規(guī)用于MM的預防性抗凝治療[18]。近年來發(fā)現(xiàn)ASA在結腸癌、胰腺癌、乳腺癌等實體腫瘤中具有抗癌作用[19]。我們在前期研究中已證實ASA具有抗MM作用[3]。由此可見，ASA在MM中具有抗凝與抗腫瘤的“雙重作用”。然而，ASA與BTZ聯(lián)合在MM中的相互作用如何，目前尚不清楚。

圖1 MM1.S和RPMI-8226細胞不同藥物處理48 h后Bcl-2蛋白表達

ASA為阿司匹林；BTZ為硼替佐米；GADPH為內參照；Bcl-2蛋白為B細胞白血病/淋巴瘤(Bcl)-2蛋白

圖2 MM1.S和RPMI-8226細胞不同藥物處理48 h后Akt蛋白表達

ASA為阿司匹林；BTZ為硼替佐米；GADPH為內參照

本研究發(fā)現(xiàn)，與ASA和BTZ組比較，ASA+BTZ組對MM細胞具有更高的增殖抑制與凋亡誘導作用。而且藥物相互作用分析顯示：二者在抑制MM細胞增殖中呈相加作用，表明ASA對BTZ抗MM效應具有化療增敏作用。由于ASA作為血栓預防藥物應用于臨床有50余年，本實驗結果為ASA聯(lián)合BTZ治療MM提供實驗依據。

研究證實，MM細胞在骨髓中積聚與細胞凋亡受抑制密切有關[20]。因此，誘導MM細胞凋亡是MM主要治療策略之一[21]。其中，Bcl-2介導的細胞凋亡機制在MM發(fā)病中起重要作用，而且Bcl-2過表達還與地塞米松(Dex)與阿霉素(ADM)的耐藥發(fā)生密切相關[22-23]。本實驗發(fā)現(xiàn)，ASA+BTZ組MM細胞Bcl-2蛋白表達低于ASA和BTZ組。特別是對于Dex耐藥MM細胞系(RPMI-8226)，ASA組可下調Bcl-2水平，與BTZ聯(lián)合時更明顯抑制Bcl-2表達。該結果提示，對于Bcl-2過表達所介導的Dex與ADM耐藥性MM而言，應用ASA治療有助于克服Dex與ADM耐藥，提高二者的臨床療效。

既往研究證實，磷酸激酶B(PKB，Akt)通路異?；罨贛M發(fā)病與耐藥中起重要作用，且與疾病分期正相關，其中Thr308與Ser473的磷酸化是Akt通路活化的關鍵步驟，提示Akt可作為MM治療靶點[24-26]。本實驗結果顯示：在MM1.S與PRMI-8226細胞中均檢測到Akt蛋白Thr308與Ser473磷酸化。與對照組相比，ASA組可抑制MM細胞Akt-Thr308與Akt-Ser473磷酸化。由于Bcl-2高表達與Akt蛋白磷酸化均與Dex耐藥相關[21, 26]，ASA恰可同時抑制RPMI-8226細胞Bcl-2水平與Akt磷酸化，進一步提供了ASA治療Dex耐藥性MM的理論依據。

研究發(fā)現(xiàn)：部分靶向藥物如表皮細胞生長因子(EGFR)抗體(昔妥西單抗)等在持續(xù)應用中還可引起某些蛋白分子的改變，繼耐導致繼發(fā)性耐藥，稱為“分子學副作用”[27]。實驗顯示：在MM細胞中，BTZ以時間依賴性誘導Akt蛋白磷酸化，繼而導致細胞對BTZ敏感性降低；抑制Akt蛋白磷酸化，一定程度上可恢復骨髓瘤細胞對BTZ藥物敏感性，表明Akt蛋白磷酸化介導BTZ繼發(fā)性耐藥發(fā)生[28]。本實驗顯示：ASA單藥可抑制MM細胞Akt-Thr308與Akt-Ser473磷酸化；BTZ單藥可誘導MM細胞的Akt-Thr308與Akt-Ser473磷酸化。相反的是，ASA與BTZ聯(lián)合組則顯著抑制MM細胞的Akt磷酸化，特別是Akt-Thr308幾乎完全受抑制。提示ASA可通過抑制Akt磷酸化對BTZ起化療增敏作用。

新近的一項Ⅱ期臨床試驗提示：對于BTZ治療曾獲PR以上療效后出現(xiàn)進展，或6個月以上復發(fā)的MM患者，再次應用BTZ治療仍然可獲40%有效率，但有30.7%的患者發(fā)生外周神經炎[29]。本實驗發(fā)現(xiàn)ASA與BTZ在MM細胞中具有相加作用，其機制為ASA增強BTZ下調Bcl-2表達與抑制BTZ誘導的Akt磷酸化。因此，ASA聯(lián)合BTZ治療MM，尤其是BTZ復發(fā)性MM患者具有潛在的應用前景。

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A Study on Interaction of Aspirin and Bortezomib in Multiple Myeloma Cells

DING Jiang-hua1, YUAN Li-ya2, CHEN Guo-an3

(1. Department of Hematology and Oncology, 171 Hospital of the PLA, Jiujiang, Jiangxi 332000, China; 2. Hematology Institution, Academy of Medical Science of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China; 3. Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To explore the interaction and its molecular mechanisms of Aspirin (ASA) and Bortezomib (BTZ) in multiple myeloma (MM) cells. Methods The MM1.S and RPMI-8226 cells were used in this study, and the effects of ASA, BTZ and ASA in combination of BTZ on cell proliferation and apoptosis in MM cells were observed. The interaction between ASA and BTZ was analyzed, and the effects on levels of Bcl-2 and total Akt protein and phosphorylated protein expression were detected. Results The inhibitory rates of cell proliferation treated within 24-72h in ASA and BTZ groups were lower than that in ASA and BTZ group (P<0.05), and drug interactions analysis showed that the additive effect existed between ASA and BTZ; after treatment for 48 h, apoptotic rates in ASA and BTZ groups were lower than that in ASA and BTZ group (P<0.05); after treatment for 48 h, Bcl-2 protein levels in MM cells were reduced in ASA and BTZ groups, while Bcl-2 protein level in ASA and BTZ group was significantly inhibited (P<0.01,P<0.05); expressions of p-Akt (Thr308) and p-Akt (Ser473) were inhibited only by ASA treatment (P<0.05), but the p-Akt (Ser473) expression was increased only by BTZ treatment in MM cells (P<0.05), while the expressions were significantly inhibited by ASA and BTZ treatments (P<0.05), but there was no effect on the total Akt level (P>0.05). Conclusion ASA may enhance the effect of BTZ against MM cells possibly through reducing Bcl-2 expression and inhibiting AKT phosphorylation induced by BTZ.

Multiple myeloma; Aspirin; Bortezomib; Drug interactions

國際合作專項基金(2011DFA32820);國家自然科學基金(81460037)

332000 江西 九江,解放軍171醫(yī)院血液腫瘤科(丁江華)；330006 南昌，江西省醫(yī)學科學研究院血液研究所(袁利亞)；330006 南昌，南昌大學第一附屬醫(yī)院血液科(陳國安)

陳國安，E-mail:gachen923@hotmail.com

R969

A

2095-140X(2015)03-0050-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.012

2015-01-18 修回時間：2015-02-20 )