電磁場(chǎng)不同處理時(shí)間對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響

周 建，馬小妮，陳克明，閆娟麗，高玉海，石文貴，方清清，謝艷芳

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·論著·

電磁場(chǎng)不同處理時(shí)間對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響

周 建，馬小妮，陳克明，閆娟麗，高玉海，石文貴，方清清，謝艷芳

目的 研究頻率50 Hz強(qiáng)度1.8 mT下的不同處理時(shí)間正弦交變電磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響。方法 體外分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代后隨機(jī)分為6組，每天于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；MTT測(cè)定細(xì)胞增殖；10 d、12 d、14 d和16 d測(cè)定ALP活性；15 d行茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色以及17 d行vonkossa 染色；第13 d ALP組織化學(xué)染色；在磁場(chǎng)處理后的4 d 和 6 d行Real-time RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)和 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2) mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果 0.5 h組可促進(jìn)細(xì)胞增殖；磁場(chǎng)處理10 d～12 d后細(xì)胞出現(xiàn)鈣化趨勢(shì)；2.5 h組在SEMFs處理16 d和18 d后ALP活性均高于對(duì)照組(P<0.05)；1.5 h組、2.0 h組和2.5 h組鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色面積均高于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)；1.5 h組Collagen-Ⅰ mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，2.0 h和2.5 h組ALP組織化學(xué)染色面積、Collagen-Ⅰ、BMP-2 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 50 Hz 1.8 mT的正弦交變磁場(chǎng)能促進(jìn)體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化，尤以處理2.5 h促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化最為明顯。

間質(zhì)干細(xì)胞；臍帶；電磁場(chǎng)；細(xì)胞分化

隨著組織工程醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)工程發(fā)展，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)電磁場(chǎng)(electromagnetic field， EMFs)能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞成骨性成熟分化[1]。有研究報(bào)道50 Hz、1.8 mT的正弦交變電磁場(chǎng)(sinusoidal electromagnetic fields, SEMFs)為促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟分化的一個(gè)效應(yīng)窗口[2-3]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來(lái)源方便的潛在多能分化干細(xì)胞，但是電磁場(chǎng)能否促進(jìn)人臍帶干細(xì)胞成骨性分化尚未可知，本實(shí)驗(yàn)旨在研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在電磁場(chǎng)作用下是否具有成骨性分化的能力。實(shí)驗(yàn)研究了50 Hz、1.8 mT不同處理時(shí)間的SEMFs對(duì)體外人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨性分化的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SEMFs能促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化以及成熟與礦化，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果有望為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用中提供一種新的定向分化手段和方向，同時(shí)也為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供一種新的替代細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清(FBS，蘭州民海生物工程公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶(購(gòu)于美國(guó)Gibco公司)，地塞米松、磷酸化抗壞血酸、β-磷酸甘油鈉、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，茜素紅(購(gòu)于上海生物工程有限公司)，堿性磷酸酶試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程有限公司)及酶標(biāo)儀(Bio Rad，Model 550)。

1.2 磁場(chǎng)發(fā)生儀 實(shí)驗(yàn)所用磁場(chǎng)發(fā)生儀由本實(shí)驗(yàn)組與蘭州理工大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所共同設(shè)計(jì)和研制完成，此磁場(chǎng)發(fā)生裝置具有磁場(chǎng)參數(shù)精準(zhǔn)大范圍可調(diào)，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可重復(fù)性[2]。

1.3 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 取正常足月產(chǎn)健康嬰兒臍帶組織(依據(jù)醫(yī)院的相關(guān)規(guī)定并經(jīng)過(guò)家屬知情同意后取材)，浸泡于DMEM/F12培養(yǎng)基中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。超凈臺(tái)內(nèi)取出臍帶，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水漂洗殘留血液，去除臍靜脈、臍動(dòng)脈及臍帶外膜，剝離Wharton膠，并將其剪碎至1 mm3大小，移至0.1%的Ⅱ型膠原酶中，37℃水浴消化，直至Wharton膠全部消化。收集消化液加入培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液過(guò)200目的細(xì)胞篩過(guò)濾，1000 r/min離心10 min，棄上清液，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸浮細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，第3天首次半量換液，以后每3 d換液1次。每天倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞達(dá)70%～80%融合后，用0.1%的胰酶消化傳代，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞分組與磁場(chǎng)處理 將第一代傳代后的細(xì)胞(P1)調(diào)整濃度4200 cell/cm2[4]接種于60 mm的一次性培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為6組，置于頻率50 Hz，0 mT磁場(chǎng)強(qiáng)度下的為對(duì)照組，另外5組分別置于頻率50 Hz，1.8 mT磁場(chǎng)強(qiáng)度下，根據(jù)每天置于磁場(chǎng)下的時(shí)間不同分為0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組和2.5 h組。

1.5 增殖分析 P1細(xì)胞接種12 h后采用如上所述的磁場(chǎng)對(duì)人臍帶干細(xì)胞進(jìn)行處理。磁場(chǎng)處理72 h(第一次磁場(chǎng)處理為0 h開(kāi)始計(jì)算時(shí)間)[4]后用含0.5%甲基噻唑基四唑(MTT)的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入2.0 ml的二甲基亞砜(DMSO)搖床震蕩10 min，待紫色結(jié)晶沉淀徹底溶解后于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD)。

1.6 成骨性分析 將P1代細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，每3 d換液1次，每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞70%～80%融合成片時(shí)加入成骨性誘導(dǎo)劑進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)(50 mg/L磷酸化抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和1×10-8mol/L的地塞米松)，在加入成骨性誘導(dǎo)劑后立即按照上述描述的分組和方法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行磁場(chǎng)處理。

1.6.1 堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：在磁場(chǎng)處理后的12 、14 、16 和18 d分別測(cè)定各組細(xì)胞的ALP活性，ALP活性測(cè)定的方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每組分別按緩沖液∶基質(zhì)液=1∶1加入充分搖勻；然后37℃水浴15 min，加入3倍于基質(zhì)液顯色液，充分混勻顯色后，測(cè)定507 nm處OD值，換算成金氏單位。

1.6.2 鈣化結(jié)節(jié)染色：磁場(chǎng)處理至15 d，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS漂洗2遍，加入10%福爾馬林固定10 min，棄固定液后流水沖洗，加入pH=8.9、0.1%的茜素紅染色緩沖液，37℃水浴1 h并輕輕搖動(dòng)，紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)后，流水沖洗去掉浮色，換固定液照相記錄染色結(jié)果。照相后采用Ipp (Image-Pro Plus 6.0)灰度分析軟件，掃描鈣化結(jié)節(jié)染色區(qū)域的面積應(yīng)用公式：培養(yǎng)皿的面積×(鈣化結(jié)節(jié)染色區(qū)域掃描面積/照片中皿的掃描面積)[5]。磁場(chǎng)處理后17 d，棄培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS漂洗2次，加入10%福爾馬林固定10 min，棄固定液，加入新配置5%的硝酸銀，紫外燈下照1 h，流水沖洗后，加入硫代硫酸鈉還原，棕色斑點(diǎn)出現(xiàn)后換固定液照相記錄結(jié)果。

1.6.3 ALP組織化學(xué)染色：磁場(chǎng)處理至13 d時(shí)進(jìn)行偶氮偶合組織化學(xué)染色，取出培養(yǎng)細(xì)胞棄培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS漂洗2次，加10%福爾馬林固定30 s，棄固定液，加α-萘基磷酸鈉和固藍(lán)的堿性緩沖液，室溫靜置待紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)后停止染色[6]，無(wú)菌PBS漂洗去掉浮色觀察并記錄結(jié)果,數(shù)據(jù)結(jié)果分析：照相后采用Ipp(Image-Pro Plus 6.0)灰度分析軟件，掃描ALP染色區(qū)域的面積應(yīng)用公式：培養(yǎng)皿的面積×(堿性磷酸酶染色區(qū)域掃描面積/照片中皿的掃描面積)，出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)后停止染色，觀察記錄結(jié)果。

1.7 基因表達(dá)水平分析

1.7.1 Total RNA提?。篜1代細(xì)胞在第一次磁場(chǎng)處理后第4天和第6天后棄培養(yǎng)液，加入無(wú)菌PBS漂洗2次，加入1 mL RNA提取細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，向裂解液中加入200 μl三氯甲烷后4℃、12000 r/min離心15 min，小心吸取上清液后加入等體積的異丙醇前后顛倒混勻冰上靜置15 min，4℃、12000 r/min離心15 min棄上清液，75%乙醇重懸浮沉淀4℃、12000 r/min離心5 min，棄上清后風(fēng)干加入無(wú)酶水溶解后-70℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，調(diào)整Total RNA的濃度。

1.7.2 反轉(zhuǎn)錄：使用TakaRa Prime ScriptTM reagent Kit(TakaRa Code：DRR037A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄出第一條cDNA鏈。反應(yīng)體系：5×Prime ScriptTM Buffer 4 μl，Prime ScriptTM RT Enzyme MixⅠ1.0 μl，Oligo dT Primer (50μmo/L) 1.0 μl，Random 6 Primer(100 μmo/L)1.0 μl，Total RNA 10 μl(1000 ng)補(bǔ)RNase Free水至20 μl、37℃反應(yīng)15 min，85℃、5 s、-20 ℃保存。

1.7.3 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在genbank查詢所需要基因目的序列的mRNA序列，后由寶生物(大連)公司根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)并合成。Collagen-I: NG_007405，F(xiàn)orward 5′-tgtgcaccaattga aggac-3′ Reverse 5′-cgcatttat tgagtacctg-3產(chǎn)物長(zhǎng)度187 bp′; BMP-2：NM_001200.2 Forward 5′-agact gcgcggccggcac-3′，Reverse 5′-agccagccgagccaacactg-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度178 bp；GAPDH：NG_007073.2 Forward 5′- ggttctgggctggctaagac -3′，Reverse5′- gcagaaagtacagggagttc -3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度143 bp。

1.7.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)：按照Applied Biosystems公司7300儀器操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中PCR反應(yīng)體系20 μl，包括SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL[2]。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，退火31 s，40個(gè)循環(huán)； Real-time RT-PCR數(shù)據(jù)分析處理采用△△Ct處理數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct表示數(shù)據(jù)的結(jié)果[7]。

2 結(jié)果

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及成骨性分化鑒定 原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)7～9 h后，顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形。在原代細(xì)胞傳一代培養(yǎng)至10 d，細(xì)胞匯合達(dá)到90%左右，細(xì)胞呈極性排列，集落形成。細(xì)胞傳代后，貼壁速度增快，生長(zhǎng)迅速；48 h后，貼壁的細(xì)胞間可見(jiàn)有細(xì)胞集落形成，細(xì)胞大多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核較大，數(shù)量也逐漸增多；4 d后首次換液，7～10 d左右細(xì)胞便鋪滿皿底，融合成片，細(xì)胞排列較整齊，分布較均勻，生長(zhǎng)較一致，雜細(xì)胞相對(duì)已較少。在成骨性誘導(dǎo)13 d后行ALP組織化學(xué)染色鑒定，15 d后行茜素紅染色進(jìn)行成骨性分化鑒定，17 d后行Vonkossa 染色鑒定，見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞增殖分析 0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組、2.5 h組OD值分別為1.744±0.083、1.594±0.058、1.618±0.057、1.577±0.050、1.570±0.083，對(duì)照組為1.618±0.058。0.5 h組OD值大于對(duì)照組(P<0.05)，其余4組OD值與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 ALP活性測(cè)定 2.5 h組在SEMFs處理16 d和18 d后ALP活性均高于對(duì)照組(P<0.05)，其余4組在SEMFs處理后不同時(shí)間段與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 6組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不同時(shí)間段ALP活性測(cè)定比較

注：對(duì)照組置于頻率50 Hz，0 mT磁場(chǎng)強(qiáng)度下；0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組和2.5 h組分別每天置于頻率50 Hz，1.8 mT磁場(chǎng)強(qiáng)度下0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h；與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.4 茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果 0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組、2.5 h組和對(duì)照組茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色面積分別為(3.23±0.75)、(3.87±0.86)、(4.56±0.47)、(5.37±0.59)、(5.877±0.61)、(3.12±0.46)cm2。1.5 h組、2.0 h組和2.5 h組染色面積均高于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，其余兩組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.5 ALP組織化學(xué)染色結(jié)果 0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組、2.5 h組和對(duì)照組ALP組織化學(xué)染色面積分別為(2.2±0.50)、(2.87±0.49)、(2.56±0.73)、(3.37±0.63)、(3.87±0.67)、(2.12±0.44)cm2。其中2.0 h組和2.5 h組ALP組織化學(xué)染色面積高于對(duì)照組(P<0.05)，其余3組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞倒置相差顯微鏡下病理形態(tài)(×100)

A.13 d后堿性磷酸酶組織化學(xué)染色鑒定；B.成骨性誘導(dǎo)15 d后茜素紅染色行成骨性分化鑒定；C.17 d后Vonkossa染色鑒定；D.傳代細(xì)胞接種48 h后鏡下病理形態(tài)；E.傳代細(xì)胞接種4 d后鏡下病理形態(tài)；F.傳代細(xì)胞接種9 d后鏡下病理形態(tài)

圖2 正弦交變電磁場(chǎng)處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第15天6組茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果

對(duì)照組置于頻率50 Hz，0 mT磁場(chǎng)強(qiáng)度下；0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組和2.5 h組分別每天置于頻率50 Hz，1.8 mT磁場(chǎng)強(qiáng)度下0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h；A.對(duì)照組；B.0.5 h組;C.1.0 h組;D. 1.5 h組;E.2.0 h組；F.2.5 h組

2.6 Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 在SEMFs處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞4 d后，0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組、2.5 h組和對(duì)照組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞Collagen-Ⅰ mRNA表達(dá)水平分別為1.01±0.23、1.09±0.56、1.10±0.35、0.93±0.17、1.09±0.18、1.02±0.24，與對(duì)照組比較，5組Collagen-Ⅰ mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞6 d后,6組Collagen-Ⅰ mRNA表達(dá)水平分別為1.47±0.54、1.45±0.23、1.67±0.29、1.80±0.22、1.99±0.26、1.35±0.22，1.5 h、2.0 h和2.5 h組均高于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)。2.5 h組Collagen-Ⅰ mRNA 表達(dá)水平顯著高于2.0 h組(P<0.01)。

2.7 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 在SEMFs處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞4 d后，0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組、2.0 h組、2.5 h組和對(duì)照組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)水平分別為1.11±0.32、0.99±0.16、1.00±0. 16、0.93±0.27、1.09±0.8、0.97±0.23，與對(duì)照組比較，5組BMP-2表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在SEMFs處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞6 d后，0.5 h組、1 h組、1.5 h組、2 h組、2.5 h組和對(duì)照組人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)水平分別為1.77±0.54、1.65±0.23、1.87±0.18、2.09±0.33、2.40±0.36、1.75±0.08，其中2.0 h組表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，2.5 h組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，其余3組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.5 h組表達(dá)水平高于2.0 h組(P<0.05)。

3 討論

干細(xì)胞作為一種具有多能分化的細(xì)胞，成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程醫(yī)學(xué)的種子細(xì)胞，人們?cè)噲D用不同的手段誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化，以期找到好的定向分化最佳手段。有文獻(xiàn)報(bào)道電磁場(chǎng)能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化[8]。同時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道，低強(qiáng)度、低頻電磁場(chǎng)對(duì)生物體的影響存在一個(gè)效應(yīng)窗口[9]，因此實(shí)驗(yàn)研究了頻率50 Hz強(qiáng)度1.8 mT下SEMFs不同處理時(shí)間(0.5～2.5 h，間隔0.5 h)對(duì)臍帶干細(xì)胞的影響，研究其是否存在時(shí)間效應(yīng)窗口。首先實(shí)驗(yàn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，然后行Vonkossa和ALP組織化學(xué)染色鑒定其成骨性分化，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)0.5 h組促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，而2.0 h和2.5 h組促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化。

ALP活性是衡量干細(xì)胞成骨性分化的標(biāo)志性指標(biāo)，電磁場(chǎng)干預(yù)可增強(qiáng)成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ALP活性已為大量研究所證實(shí)[10-11]。因此實(shí)驗(yàn)以ALP作為一個(gè)衡量指標(biāo)，檢測(cè)SEMFs對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每日SEMFs處理2.0 h和2.5 h能增加ALP活性和ALP組織化學(xué)染色面積。鈣鹽作為干細(xì)胞成骨性分化的一個(gè)重要的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)在成骨性誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEMFs促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞鈣鹽的沉積，茜素紅染色結(jié)果表明2.0 h和2.5 h組顯著增加人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平證明了SEMFs促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化，同時(shí)SEMFs促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化存在一個(gè)時(shí)間效應(yīng)窗口。

研究發(fā)現(xiàn)BMP-2具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨性分化能力[12-13], 以及collagen-Ⅰ是干細(xì)胞成骨性分化的基礎(chǔ)，因此實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SEMFs對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA表達(dá)水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SEMFs能促進(jìn)BMP-2和Collagen-Ⅰ mRNA表達(dá)，存在一定的時(shí)間依賴性，尤以2.0 h和2.5 h組作用顯著。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)處理特定的時(shí)間點(diǎn)，SEMFs能顯著促進(jìn)成骨性分化的相關(guān)基因的表達(dá)，這可能與當(dāng)前有人提出的電磁場(chǎng)生物效應(yīng)窗口理論相一致[14-15]。實(shí)驗(yàn)從分子水平表明SEMFs能促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化，同時(shí)存在時(shí)間效應(yīng)窗口。

實(shí)驗(yàn)以頻率50 Hz強(qiáng)度1.8 mT下不同處理時(shí)間(0.5～2.5 h間隔0.5 h)分析了SEMFs對(duì)ALP活性、鈣鹽以及基因表達(dá)的影響，證明了SEMFs對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化，同時(shí)存在時(shí)間的依賴性。實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與已有報(bào)道電磁場(chǎng)促進(jìn)干細(xì)胞成骨性分化窗口效應(yīng)理論結(jié)果一致[16]，我們將以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步從電磁誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化機(jī)理去研究SEMFs對(duì)干細(xì)胞分化的影響，為再生醫(yī)學(xué)和組織工程醫(yī)學(xué)應(yīng)用干細(xì)胞定向分化提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Electromagnetic Field in Different Treatment Time on Proliferation and Differentiation of Human Umbilical Cord of Mesenchyme Stem Cells in Vitro

ZHOU Jian, MA Xiao-ni, CHEN Ke-ming, YAN Juan-li, GAO Yu-hai, SHI Wen-gui, FANG Qing-qing, XIE Yan-fang

(Osteology Institution, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To investigate effect of different treatment time of sinusoidal electromagnetic fields (SEMFs) under 50 Hz 1.8 mT on proliferation and differentiation of human umbilical cord of mesenchyme stem cells in vitro. Methods The human umbilical cord of mesenchyme stem cells were isolated in vitro, and randomly divided into 6 groups after one passage. The cell configurations were observed every day under inverted phase contrast microscope; MTT colorimetric assay was used to detect the cell proliferation; ALP activities were detected on 10thd, 12thd, 14thd and 16thd after SEMFs treatment; calcified nodules were stained with alizarin red on 15thd and with vonkossa staining on 17thd after SEMFs treatment; ALP histochemical staining was performed on 13thd after SEMFs treatment; the expression changes of Collagen-Ⅰ and BMP-2 mRNA were detected with real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) on 4thd and 6thd after SEMFs treatment. Results The SEMFs promoted the cell proliferation in 0.5 h group; the calcified tendency was found on 10thd-12thd after SEMFs treatment; the ALP activities on 16thd and 18thd after SEMFs treatment in 2.5 h group were significantly higher than those in control group (P<0.05); the areas of alizarin red of calcified nodules in 1.5 h, 2.0 h and 2.5 h groups were significantly larger than that in control group (P<0.01，P<0.05); Collagen-Ⅰ mRNA expression level in 1.5 h group was higher than that in control group (P<0.05), and ALP histochemical staining areas, expression levels of Collagen-Ⅰ and BMP-2 mRNA in 2.0 h and 2.5 h groups were significantly larger and higher than those in control group (P<0.05，P<0.01). Conclusion Sinusoidal electromagnetic fields under 50 Hz 1.8 mT can promote osteoplastic differentiation of human umbilical cord of mesenchyme stem cells in vitro, and the differentiation is the most obvious in 2.5 h group.

Mesenchymal stem cells； Umbilical cord； Electromagnetic fields； Cell differentiation

國(guó)家自然科技基金(81270963，81471090);甘肅省科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(09ZNKDA025)

730050 蘭州,蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所

陳克明，E-mail:chkeming@yahoo.com.cn

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0011-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.003

2014-10-04 修回時(shí)間：2014-12-28)