脈沖電磁場與正弦交變電磁場對成骨細胞增殖與成熟礦化的比較研究

閆娟麗，陳克明，周 建，方清清，馬慧萍

?

·論著·

脈沖電磁場與正弦交變電磁場對成骨細胞增殖與成熟礦化的比較研究

閆娟麗，陳克明，周 建，方清清，馬慧萍

目的 探討0.6 mT 50 Hz脈沖電磁場和1.8 mT 50 Hz正弦交變電磁場對大鼠顱骨成骨細胞增殖與成熟礦化的影響。方法 采用酶消化法分離大鼠乳鼠顱骨成骨細胞，接種培養(yǎng)于10% 胎牛血清(FBS)的α-MEM 培養(yǎng)基中，成骨細胞融合到80%～90%，傳代培養(yǎng)，隨機分成3組，分別為對照組、脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組，分別測定細胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性，并進行堿性磷酸酶染色和茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色。結(jié)果 脈沖電磁場組OD值明顯高于正弦交變電磁場組和對照組(P<0.01)，正弦交變電磁場組明顯低于對照組(P<0.01)；第6天脈沖電磁場組ALP活性明顯高于正弦交變電磁場組和對照組(P<0.01),第9天脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組ALP活性均明顯高于對照組(P<0.01)。脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組ALP染色、茜素紅面積和克隆數(shù)均顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)論 脈沖電磁場和正弦交變電磁場都能最終促進成骨細胞的成熟礦化，使其形成新骨，但其作用機理不同。

脈沖電磁場；正弦交變電磁場；成骨細胞；骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損、繼而引起骨骼脆性增加和骨折危險度升高的一種全身骨代謝障礙疾病[1]，被稱為無聲無息、靜悄悄發(fā)生的流行病，臨床以腰背疼痛、身長縮短、駝背,甚至骨折為主要表現(xiàn)[2]。越來越多的證據(jù)顯示[2-3]，生物物理干預可提供一種安全有效地抑制骨質(zhì)疏松的方法，使骨量增加而不破壞骨的重建過程。電磁場可以改變?nèi)梭w電磁場環(huán)境，促進成骨細胞的增生，抑制骨吸收的活力，使骨密度增加，并能改善骨疼痛，故有利于骨質(zhì)疏松的治療[4-6]。本實驗組已研究出不同強度脈沖電磁場(pulse electromagnetic fields， PEMFs)和正弦交變電磁場(sinusoidal electromagngetic fields， SEMFs)對成骨細胞增殖和成熟礦化的強度篩選[7-8]，分別篩選出0.6 mT、50 Hz脈沖電磁場和1.8 mT、50 Hz正弦交變電磁場為促進成骨細胞成熟礦化的最佳強度，交變電磁場是交變電流提供電源產(chǎn)生的磁場，脈沖電磁場是由脈沖電源提供產(chǎn)生的電磁場[9]，其磁場波形不同，其最佳強度也不同，本實驗通過比較脈沖電磁場和正弦交變電磁場對成骨細胞的增殖及成熟礦化的影響，找到最佳波形電磁場治療骨質(zhì)疏松癥，從而為研究電磁場骨質(zhì)疏松治療儀提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 電磁場發(fā)生裝置 超低頻電磁場細胞處理儀由本實驗室自行研制(專利號：ZL 201120528654.3)，主要由控制軟件及電腦、信號采集卡、磁場電源和磁場線圈等組成。培養(yǎng)細胞置于磁場線圈內(nèi)，線圈長27 cm，內(nèi)徑10 cm，多組線圈經(jīng)過特殊設計和繞制后可在內(nèi)部產(chǎn)生一個12 cm×9 cm×9 cm的均勻磁場區(qū)，磁場均勻度小于1/1000，可確保在此范圍內(nèi)的所有細胞均受到相同磁場的處理。磁感應線圈經(jīng)紫外線照射消毒放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，通過導線與外部控制裝置相連。實驗期間培養(yǎng)箱內(nèi)溫度控制在(37±0.2)℃。

1.2 實驗動物 出生48 h以內(nèi)的8只SPF級SD大鼠乳鼠[甘肅省中醫(yī)學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(甘)2004-0006-152]。

1.3 試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(蘭州民海生物公司)；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、磷酸化的維生素C、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、二甲基亞砜(DMSO)、甲基噻唑基四唑(MTT)、茜素紅均來自于Sigma公司；堿性磷酸酶試劑測定盒(南京建成生物工程研究所)；青霉素、鏈霉素購自華北制藥;電磁場處理儀；倒置相差顯微鏡(Olympus， Japan)、細胞培養(yǎng)箱(Thermo Revco， USA);全波長酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠顱骨成骨細胞的培養(yǎng)：8只大鼠乳鼠脫頸處死后，用75%乙醇浸泡10 min，剝?nèi)★B骨，剪碎至1 mm3左右，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗兩次，用0.25%胰蛋白酶[含1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]37℃水浴消化10 min，消化2次，棄掉上清，用0.1%Ⅱ型膠原酶(含1 mmol/L EDTA)37℃水浴消化10 min，棄掉上清，剩余的骨碎片用0.1%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化20 min，消化3次，收集消化液，每次消化完的消化液用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基終止消化，收集消化液，用200目的細胞篩過濾后，1000 r/min離心10 min，收集細胞，將細胞密度調(diào)整至2×105cell/mL接種于100 mm培養(yǎng)皿中，24 h后用PBS漂洗2次，換含新鮮培養(yǎng)基，待細胞生長融合到80%，進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 分組及細胞增殖分析：原代培養(yǎng)成骨細胞生長融合到80%，用0.25%胰蛋白酶消化懸浮后，以細胞密度1×104cell/ml傳代接種于35 mm中皿(P1)，隨機分為脈沖電磁場組、正弦交變電磁場組和對照組，每組3個平行做3份，次日細胞貼壁生長后開始磁場處理，強度分別為脈沖電磁場0.6 mT(脈沖電磁場組)、正弦交變電磁場1.8 mT(正弦交變電磁場組)，1.5 h/d，對照組每天同樣在磁場線圈中放置1.5 h，但不通電，故磁場強度為0 mT。線圈放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，磁場處理3 d后，棄去培養(yǎng)液，加入2 ml 0.5%MTT，在37℃孵育4 h，棄MTT,加入2 ml DMSO，輕微震蕩10 min,在520 nm處測吸光度(OD)。

1.4.3 成骨性分化分析：成骨細胞以1×105cell/ml的密度接種于35 mm中皿，待融合到80%，加成骨性誘導劑(1×10-8mol/L地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸納，1×10-4mol/L磷酸化的維生素C)，次日開始電磁場處理。

1.4.4 堿性磷酸酶(ALP)活性的測定：磁場處理6、9、12 d測ALP活性，測定方法按試劑盒說明書進行，棄培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，加入基質(zhì)液和緩沖液250 μl，輕微震蕩混勻，37℃孵育15 min,加入顯色液750 μl,在520 nm處測OD。

1.4.5 ALP染色：電磁場處理9 d，進行ALP染色，用PBS漂洗2次，10%甲醛固定30 s，PBS漂洗2次，加入ALP染色液(pH=9.2的Michaelis氏巴比妥-HCl緩沖液20 ml中含α-萘基磷酸鈉和固藍B鹽各20 mg)。當出現(xiàn)紫褐色斑點時即棄染色液，PBS漂洗，觀察，照相。

1.4.6 鈣化結(jié)節(jié)染色：電磁場處理12 d，進行鈣化結(jié)節(jié)染色，PBS洗兩遍，3.7%甲醛固定10 min，PBS漂洗兩遍；加入0.1%茜素紅Tris-HCL染色液(pH=8.3)，37℃水浴60 min，PBS漂洗，干燥后計數(shù)，照相。

2 結(jié)果

2.1 成骨細胞形態(tài)學觀察 原代成骨細胞培養(yǎng)4 h后開始貼壁，初期呈三角形、紡錘形或橢圓形，貼壁24 h后成骨細胞開始增殖，72 h后細胞開始融合為單層；磁場處理4～5 d后成骨細胞變得更加飽滿，磁場處理9 d ALP染色，磁場處理10～12 d可見明顯成熟的礦化結(jié)節(jié)，磁場處理12 d，茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)，見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下成骨細胞形態(tài)觀察(×40)

A.原代培養(yǎng)4 h，細胞呈三角形、紡錘形和橢圓形；B.磁場處理4 d成骨細胞變得更加飽滿;C.磁場處理9 d ALP 染色;D.磁場處理12 d形成成熟礦化結(jié)節(jié);E.磁場處理12 d茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)

2.2 MTT增殖結(jié)果 脈沖電磁場組、正弦交變電磁場組和對照組OD值分別為4.043±0.062、2.100±0.071、3.142±0.050，脈沖電磁場組OD值明顯高于對照組(P<0.01)，正弦交變電磁場組明顯低于對照組(P<0.01)。脈沖電磁場組與正弦交變電磁場組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 ALP活性測定 第6天脈沖電磁場組ALP活性明顯高于對照組和正弦交變電磁場組(P<0.01),正弦交變電磁場組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第9天脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組ALP活性均明顯高于對照組(P<0.01)，脈沖電磁場組與正弦交變電磁場組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第12天3組ALP活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 3組成骨細胞堿性磷酸酶活性比較

注：與對照組比較，bP<0.01;與正弦交變電磁場組比較，dP<0.01

2.4 ALP染色結(jié)果 脈沖電磁場組、正弦交變電磁場組和對照組ALP染色克隆面積分別為(0.544±0.114)、(0.599±0.126)、(0.127±0.027)cm2，ALP染色克隆數(shù)分別為5342.753±1227.433、5320.330±267.524、1728.526±787.369。脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組ALP染色克隆面積和克隆數(shù)均明顯高于對照組(P<0.01)，脈沖電磁場組與正弦交變電磁場組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.5 茜素紅染色結(jié)果 脈沖電磁場組、正弦交變電磁場組和對照組ALP茜素紅染色面積分別為(0.066±0.011)、(0.042±0.005)、(0.004±0.002)cm2，茜素紅染色克隆數(shù)分別為1933.332±83.978、1651.671±176.684、84.667±21.939。脈沖電磁場組與正弦交變電磁場組茜素紅染色面積和克隆數(shù)均顯著高于對照組(P<0.01)，脈沖電磁場組與正弦交變電磁場組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

A B C

A.脈沖電磁場組；B.正弦交變電磁場組；C.對照組

圖2 第9天3組成骨細胞堿性磷酸酶組織化學染色

A B C

A.脈沖電磁場組；B.正弦交變電磁場組；C.對照組

圖3 第12天3組成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)染色

3 討論

隨著人口壽命及老年人口不斷增加，作為中老年退行性重要疾病之一的骨質(zhì)疏松癥及其所引起的骨折已成為一個嚴重的社會問題，從而備受老年病學者的關(guān)注。WHO已把骨質(zhì)疏松癥列為僅次于心血管病的第二大公眾健康問題[10]。骨質(zhì)疏松癥的防治一般可分為藥物治療和物理治療,藥物治療在臨床上使用廣泛,臨床上通常給予鈣劑類或雌激素藥物治療[11],但由于老年人對鈣的攝入、吸收和利用能力下降，其不良反應多，費用高，患者依從性差，使其應用受到了很大的限制，所以探索新的治療途徑十分必要。

越來越多的證據(jù)顯示[2-3]，生物物理干預可能提供一種安全有效地抑制并在一定年齡段內(nèi)逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松的方法，使骨量增加而不破壞骨的重建過程。低頻電磁場在骨形成、骨重建中的作用已經(jīng)被近年來的大量研究所證明[12-19]，對這一現(xiàn)象的解釋目前多基于著名的壓電效應以及機械應力是刺激成骨第一信號的生物物理學理論。隨時間變化的電場產(chǎn)生磁場,隨時間變化的磁場產(chǎn)生電場,相互依存的電場和磁場總稱為電磁場。當電磁場作用在生物體系上時,生物體系中的各種物質(zhì)將以感應的方式對交變的電場和磁場做出應答與反應,從而產(chǎn)生電磁場的生物學效應。研究顯示電磁場能克服傳統(tǒng)治療方法的缺陷，對骨質(zhì)疏松引起的疼痛、骨量減少、骨密度降低具有一定的治療作用，并且已經(jīng)部分應用于骨質(zhì)疏松癥的康復治療中。電磁場改變?nèi)梭w電磁場環(huán)境，促進成骨細胞的增生，抑制骨吸收的活力，使骨密度增加，并能減輕骨疼痛，故有利于骨質(zhì)疏松的治療。普遍認為電磁場的作用存在“窗效應”現(xiàn)象,即只有在一定相對狹窄的強度(或頻率)范圍內(nèi),電磁場才具有生物學效應。本實驗室也證明了“窗效應”現(xiàn)象，本實驗室已研究出的兩種不同波形的電磁場(脈沖電磁場和正弦交變電磁場)，通過不同磁場強度對成骨細胞增殖與成熟礦化的影響，篩選出最佳強度0.6 mT、50 Hz脈沖電磁場和1.8 mT、50 Hz正弦交變電磁場以促進成骨細胞的增殖、成熟礦化。但沒有系統(tǒng)性的比較哪一個是最佳的電磁場，本實驗就此問題對成骨細胞的細胞形態(tài)、增殖、ALP活性、ALP組織化學染色、鈣結(jié)節(jié)染色進行了系統(tǒng)的對比研究。從細胞形態(tài)來看，0.6 mT、50 Hz脈沖電磁場和1.8 mT、50 Hz 正弦交變電磁場沒有引起細胞形態(tài)的變化，即從細胞形態(tài)來看，脈沖電磁場和正弦交變電磁場沒有改變細胞的形態(tài).

MTT增殖實驗顯示，脈沖電磁場促進了成骨細胞的增殖，而正弦交變電磁場抑制了成骨細胞的增殖，細胞增殖是生物最根本的生命活動,是個體生長和生命延續(xù)的基本保證,在正常情況下,細胞遵循著一定的細胞周期,通過自我復制進行增殖,磁場對細胞周期的影響主要表現(xiàn)在對細胞的S、G2期進程起促進或阻斷作用,脈沖電磁場與正弦交變電磁場通過不同的方式影響細胞的周期，從而到達抑制或促進細胞增殖的作用。

ALP是成骨性分化的早期標志。ALP活性顯示，脈沖電磁場和正弦交變電磁場對ALP活性的影響從第6天到第9天明顯上升，第12天又開始下降，第6天，脈沖電磁場組ALP活性明顯高于對照組,正弦交變電磁場組與對照組比較無顯著差異。第9天，脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組ALP活性均明顯高于對照組。由此說明脈沖電磁場從一開始就對ALP的活性產(chǎn)生影響，而正弦交變電磁場是從中后期才開始對成骨細胞的ALP活性產(chǎn)生影響。

ALP染色和鈣化結(jié)節(jié)染色說明成骨細胞成熟礦化的情況，這有利于新骨的形成，脈沖電磁場組和正弦交變電磁場組ALP染色、茜素紅染色克隆面積和克隆數(shù)均顯著高于對照組，而兩組間比較無統(tǒng)計學意義，說明脈沖電磁場和正弦交變電磁場同樣程度的促進鈣鹽的沉積，有利于新骨的形成。綜上所述，脈沖電磁場和正弦交變電磁場都能最終促進成骨細胞的成熟礦化，使其形成新骨，但無論是影響細胞周期還是影響成骨性分化的指標其作用機理不同。

[1] 李險峰.骨質(zhì)疏松癥的臨床類型及其特點[J].新醫(yī)學,2007,38(5):344-347.

[2] 李志鋒,程國政,翟遠坤,等.脈沖電磁場防治骨質(zhì)疏松癥的研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2009,15(2):158-161.

[3] 楊淑蓉,吳靖川,施海虹,等.POP-01脈沖電磁場型骨質(zhì)疏松治療系統(tǒng)的應用[J].上海第二醫(yī)科大學學報,2004,24(6):469-471.

[4] 賈雪,何成奇.脈沖電磁場治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進展[J].華西醫(yī)學,2009,24(1):247-250.

[5] 朱淑霞,李永華,宋治遠,等.電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化時細胞增殖[J].第三軍醫(yī)大學學報，2008,30(5):421-423.

[6] 李麗榮,羅二平,申廣浩,等.脈沖電磁場對體外培養(yǎng)成骨細胞的影響[J].中國醫(yī)學物理學雜志,2005，22(1):388-390.

[7] Zhou J, Ming L G, Ge B F,etal. Effects of 50 Hz sinusoidal electromagnetic fields of different intensities on proliferation, differentiation and mineralization potentials of rat osteoblasts[J].Bone, 2011,49(4):753-761.

[8] 閆娟麗,王鳴剛,陳克明,等.不同強度50Hz脈沖電磁場促進大鼠顱骨成骨細胞礦化成熟最佳參數(shù)的篩選[J].中國生物化學與分子生物學報,2014，30(7):721-729.

[9] 周建,陳克明,葛寶豐,等.電磁場的應用與研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(24):5162-5168.

[10]甄仙梅,曹芳.老年骨質(zhì)疏松癥預防與治療進展[J].中國保健營養(yǎng),2013,23(1):486-487.

[11]Lewiecki E M. Prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Obstet Gynecol Clin Nor Amer, 2008,35(2):301-315.

[12]關(guān)志成,楊小衛(wèi),王黎明,等.脈沖電磁場對骨質(zhì)疏松的生物效應[J].高電壓技術(shù),2007,33(2):1-6.

[13]Sun L Y, Hsieh D K, Yu T C. Effect of pulsed electromagnetic field on the proliferation and differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Bioelectromagnetics, 2009,30(4):251-260.

[14]Rosen C J, Compston J E, Lian J B. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism[M].John Wiley & Sons, 2009.

[15]Martino C F, Belchenko D, Ferguson V,etal.The effects of pulsed electromagnetic fields on the cellular activity of SaOS-2 cells[J].Bioelectromagnetics, 2008,29(2):125-132.

[16]朱淑霞,宋治遠,羅向東,等.電磁場干預大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌方向誘導分化的研究[J].武警醫(yī)學院學報,2009,18(5):377-379,395.

[17]孫振強,紀衛(wèi)政,李濤,等.供體骨髓間充質(zhì)干細胞抑制肝移植大鼠免疫排斥的研究[J].中華消化外科雜志,2009,8(6):449-452.

[18]葉青,劉曦明,黃武,等.仿生脈沖電磁場對大鼠骨密度下降預防治療作用的實驗研究[J].華南國防醫(yī)學雜志,2008,22(2):52-55.

[19]周建,陳克明,葛寶豐.50Hz正弦交變電磁場促進體外培養(yǎng)成骨細胞分化成熟的雙“強度窗”效應[J].生物物理學報,2011,27(6):507-516.

Comparative Study of Effects of Pulsed Electromagnetic Fields and Sinusoidal Electromagnetic Fields on Osteoblastic Proliferation and Maturity Mineralization in Rats

YAN Juan-lia, CHEN Ke-minga, ZHOU Jiana, FANG Qing-qinga, MA Hui-pingb

(a. Osteology Institution, b. Pharmacy, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To investigate effects of 0.6 mT 50 Hz pulsed electromagnetic fields (PEMFs) and 1.8 mT 50 Hz sinusoidal electromagnetic fields (SEMFs) on proliferation and maturity mineralization of skull osteoblasts (OB) in rats. Methods Enzyme digestion was used to obtain bone cells from neonatal SD rats' skulls, and the cells were cultured in α-MEM containing 10% fetal bovine serum (FBS). When the OB values reached 80%-90% confluence, they were given serial subcultivation and were randomly divided into control group, PEMFs group and SEMFs group. The cell proliferations, alkaline phosphatase (ALP) activity, ALP staining and calcified node staining were respectively detected in the three groups. Results The optical density (OD) value in PEMFs group was significantly higher than those in SEMFs and control groups (P<0.01), while the value in SEMFs group was significantly lower than that in control group (P<0.01); ALP activity on 6thd after treatment was significantly increased compared with those in control and SEMFs groups (P<0.01), and ALP activities on 9thd after treatment in PEMFs and SEMFs groups were significantly increased compared with that in control group (P<0.01). The values of ALP staining, Alizarin red area and cloning number in PEMFs and SEMFs groups were significantly higher than those in control group (P<0.01). Conclusion Both PEMFs and SEMFs can eventually promote osteoblasts proliferation and maturity mineralization, and then induce formation of new bones with different mechanisms.

Pulsed electromagnetic fields; Sinusoidal electromagnetic fields; Osteoblasts; Osteoporosis

國家自然科技基金(81270963，81471090);甘肅省科技重大專項資助項目(09ZNKDA025)

730050蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所(閆娟麗、陳克明、周建、方清清)，藥材科(馬慧萍)

陳克明：E-mail:chenkm@lut.cn

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0006-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.002

2014-06-16 修回時間：2014-11-28)