大鼠顱骨成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的分離純化與比較研究

謝艷芳，陳克明，馬小妮，石文貴，周 建

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骨科基礎(chǔ)研究

·論著·

大鼠顱骨成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的分離純化與比較研究

謝艷芳，陳克明，馬小妮，石文貴，周 建

目的 探討大鼠顱骨中骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分離純化方法，并分別比較細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性和成骨特異性蛋白的表達(dá)情況。方法 分別采用序列酶消化和EDTA螯合法，從SPF級(jí)新生SD大鼠的顱骨中分離培養(yǎng)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行HE染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色、骨鈣素(BGP)免疫熒光染色；采用偶氮偶合法對(duì)兩種細(xì)胞ALP進(jìn)行染色，并檢測(cè)其活性；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)兩種細(xì)胞的Ⅰ型膠原和BGP的表達(dá)量。結(jié)果 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察及HE染色表明，骨細(xì)胞多呈星狀或樹(shù)枝狀且有較多突觸，而成骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形且突觸較少；Ⅰ型膠原免疫組化染色與Western blot結(jié)果表明，Ⅰ型膠原在成骨細(xì)胞中表達(dá)量較高，呈棕黃色，骨細(xì)胞中表達(dá)量較低；而B(niǎo)GP免疫熒光染色與Western blot顯示，成骨細(xì)胞中BGP表達(dá)較低，而在骨細(xì)胞中表達(dá)較高，細(xì)胞熒光染色與HE染色結(jié)果相似；ALP染色結(jié)果表明，ALP在成骨細(xì)胞中表達(dá)較高，骨細(xì)胞中表達(dá)較低；ALP活性檢測(cè)與ALP染色結(jié)果相似。結(jié)論 采用序列酶消化及EDTA螯合法，可以從大鼠顱骨中分離得到較純的骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，利用HE染色、免疫組化、免疫熒光染色、Western blot等技術(shù)，可以對(duì)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞進(jìn)行分離純化與研究。

骨細(xì)胞；成骨細(xì)胞；免疫組化；膠原Ⅰ型；骨鈣素;大鼠, Sprague-Dawley

成骨細(xì)胞作為骨修復(fù)與骨重建的主要承擔(dān)者，被認(rèn)為是藥物、電磁場(chǎng)等治療骨質(zhì)疏松癥研究的基礎(chǔ)[1]。然而最新研究表明，占骨組織 90%～95%的骨細(xì)胞才是骨代謝調(diào)節(jié)的“大腦”[2]。骨細(xì)胞是位于骨基質(zhì)內(nèi)礦化陷窩的一種高度分化細(xì)胞，研究表明，骨細(xì)胞不同于位于骨基質(zhì)表面的成骨細(xì)胞，其主要任務(wù)不是合成骨基質(zhì)和分泌礦物鹽，而是感受來(lái)自體內(nèi)血液及神經(jīng)免疫系統(tǒng)的一系列信號(hào)，決定是否啟動(dòng)骨吸收或骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞，因而在防治骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病中占有比成骨細(xì)胞更重要的位置[3]。本課題組前期研究已證實(shí)，黃酮類(lèi)化合物、超低頻電磁場(chǎng)等都具有促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟礦化的能力[4]，對(duì)于骨細(xì)胞，這些治療方法是否同樣有效，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥治療新途徑的開(kāi)發(fā)具有重要意義。然而由于目前可供體外實(shí)驗(yàn)研究的骨細(xì)胞系較少，并且有效穩(wěn)定的骨細(xì)胞分離方法尚不十分明確[5]。因此，本研究旨在建立完善的從大鼠顱骨中分離純化骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的方法，并從細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶(ALP)活性和成骨特異性蛋白的表達(dá)等對(duì)二者進(jìn)行比較研究，為今后黃酮類(lèi)化合物、超低頻電磁場(chǎng)等治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)新生SD大鼠10只，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(甘) 2004-0006-152；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco， USA)；胎牛血清FBS(HyClone)；新生牛血清CS(PAA)胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；ALP測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；免疫組化染色試劑盒(北京博奧森)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)、骨鈣素(BGP)一抗購(gòu)自abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)；BCA蛋白定量試劑盒；FITC標(biāo)記的免疫熒光二抗(KPL公司)，伊紅、蘇木素(上海源葉公司)。

1.2 儀器 正置熒光顯微鏡(OLYMPUS， Japan),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Revco，USA),倒置相差顯微鏡(OLYMPUS， Japan),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heraeus， German),紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad公司),數(shù)碼凝膠圖像分析儀(bio-Tanon),電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀和酶標(biāo)儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)：將乳鼠置于75%乙醇中浸泡處死，在無(wú)菌條件下取其顱骨并去除骨膜及結(jié)締組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.8)清洗3次；將骨片剪碎(大小約1 mm×1 mm×1 mm)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，0.25%胰酶消化2次(37℃，每次10 min)，棄上清液，0.1%的Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化4次( 37℃,每次20 min)，收集合并上清液，加入5 ml含血清的培養(yǎng)基中止酶消化，150目濾網(wǎng)過(guò)濾3次，1000 r/min離心10 min； 棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10% FBS，青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，吹打均勻并計(jì)數(shù)。原代細(xì)胞懸液以3×105個(gè)/ml接種于大皿中培養(yǎng)，每皿10 ml，37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%皿底后，胰蛋白酶消化傳代(標(biāo)記為P1 代)，此為成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。

1.3.2 骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)：骨細(xì)胞的序列消化分離、培養(yǎng)及傳代，主要參考Lee等[6]分離方法，經(jīng)過(guò)改進(jìn)，具體分離、培養(yǎng)和傳代步驟如下：將分離成骨細(xì)胞時(shí)消化剩余的骨碎片棄去上清液后，PBS清洗骨片3次，用0.02% EDTA溶液(含0.1%的小牛血清白蛋白)第6次消化骨片，棄去上清液，PBS清洗骨片3次。緊接著用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化第7次(37℃，每次20 min)，收集上清到新的培養(yǎng)瓶中，并加入5 ml含血清的培養(yǎng)基中止酶消化。交替利用0.02% EDTA溶液和0.1%的Ⅰ型膠原酶化第8次和第9次，收集并合并上清液，每次交替都用PBS溶液清洗骨片3次。將上清150目濾網(wǎng)過(guò)濾3次，1000 r/min離心10 min后棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含5%胎牛血清和5%的小牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，吹打均勻并計(jì)數(shù)。原代細(xì)胞懸液以3×105個(gè)/ml接種于Ⅰ型膠原酶包裹的10 cm大皿中，37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基，至細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%皿底后胰蛋白酶消化傳代。

1.3.3 HE染色：將P1代細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.1% TritonX-100透膜20 min，PBS漂洗3次。向爬片滴加1 ml蘇木素染液進(jìn)行初染，10 min后流水沖洗，滴加鹽酸乙醇封化液封化1 s，將爬片立刻放入流水沖洗15 min。再加入1 ml伊紅染液進(jìn)行復(fù)染，5 min后依次經(jīng)過(guò)低濃度到高濃度的乙醇溶液進(jìn)行脫水，每次2 min，最后將爬片浸泡于二甲苯溶液中2 min后封片。正置熒光顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。

1.3.4 Ⅰ型膠原的免疫組化染色：將P1代細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.5% Triton-X100透膜20 min，PBS漂洗3次后滴加3% 過(guò)氧化氫并37℃孵育15～20 min，已消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS漂洗3次后滴加山羊血清工作液并37℃孵育，15～20 min后傾去勿洗，滴加Ⅰ型膠原抗體(1∶500)并4℃過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次3 min，之后滴加相應(yīng)的二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS漂洗3次每次3 min，最后利用DAB顯色劑進(jìn)行顯色，流水沖洗后封片，正置熒光顯微鏡觀(guān)察兩種細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.5 骨鈣素(BGP)免疫熒光染色：將P1代細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.5% Triton-X100透膜20 min，PBS漂洗3次后滴加山羊血清工作液并37℃孵育，15～20 min后傾去勿洗，滴加BPG抗體(1∶500)并4℃過(guò)夜，PBS漂洗3次每次3 min，之后滴加FITC標(biāo)記的免疫熒光二抗并37℃避光孵育。60 min后PBS漂洗3次，每次3 min。封片后置于正置熒光顯微鏡下，488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)下進(jìn)行比較觀(guān)察。

1.3.6 ALP的偶氮偶合法染色：將P1代細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng)，3 d后取出爬片并用PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛固定30 s，PBS漂洗3次，后轉(zhuǎn)入基質(zhì)液(20 ml，pH=8.9的巴比妥鈉-HCL緩沖液中含α-萘基磷酸鈉和固藍(lán)RR鹽各20 mg)中反應(yīng)15 min,當(dāng)出現(xiàn)黃褐色斑點(diǎn)時(shí)棄去基質(zhì)液，PBS液沖洗3次后封片，置于正置熒光顯微鏡下進(jìn)行比較觀(guān)察。

1.3.7 ALP活性測(cè)定：將兩種原代細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板，每3天更換一次培養(yǎng)基，6 d后測(cè)定ALP活性，具體方法如下：棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各0.3 ml混勻，37℃水浴15 min后，加入0.9 ml顯色液，520 nm測(cè)定酚標(biāo)準(zhǔn)及樣本吸光值,根據(jù)公式換算為金氏單位。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析：將兩種P1細(xì)胞分別以5×104個(gè)/ml接種于中皿，3 d后提取總蛋白，利用Western blot檢測(cè)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原的表達(dá)量。具體方法如下：將貼壁細(xì)胞4℃預(yù)冷的PBS漂洗2遍后，加入500 μl的細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、pH=8.0、150 mmol/L NaCl、100 mg/L PMSF、1 mg/L抑蛋白酶肽、1%吐溫-20、0.5%去氧膽酸鈉、1% SDS)于冰上靜置30 min使細(xì)胞充分裂解。4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的測(cè)定。95℃變性4 min，各組取含20 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床振蕩封閉2 h，然后分別加入Ⅰ型膠原一抗(1：1 000稀釋)，4℃過(guò)夜。次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1：10 000稀釋) 37℃孵育2 h，每進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)前PVDF膜均用4℃預(yù)冷的TBST搖床漂洗4次，每次8 min，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白，X光片的曝光時(shí)間視實(shí)驗(yàn)效果而定，灰度值使用Image-Pro plus 6.0軟件掃描測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下成骨細(xì)胞形態(tài)多呈梭形或成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，骨細(xì)胞則形態(tài)較豐滿(mǎn)，有多個(gè)突觸結(jié)構(gòu)，呈星狀或樹(shù)枝狀，細(xì)胞間通過(guò)突觸互相連接；經(jīng)HE染色后可見(jiàn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞在形態(tài)方面存在明顯差別，成骨細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，而骨細(xì)胞因有較多突觸而呈放射狀，細(xì)胞間幾乎沒(méi)有突觸連接，而骨細(xì)胞呈放射狀，并通過(guò)大量的樹(shù)突結(jié)構(gòu)相互連接，見(jiàn)圖1。

2.2 Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果 成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)量較高呈深棕黃色，而骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原的表達(dá)量明顯較低，呈淺棕色，見(jiàn)圖2。

圖1 成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

A.光學(xué)顯微鏡下成骨細(xì)胞(×20)；B.光學(xué)顯微鏡下骨細(xì)胞(×20)；C.成骨細(xì)胞HE染色(×40)；D.骨細(xì)胞HE染色(×40)

圖2 成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原免疫組化染色結(jié)果(DAB×40)

A.成骨細(xì)胞；B.骨細(xì)胞

2.3 BGP免疫熒光染色結(jié)果 BGP在成骨細(xì)胞中表達(dá)較低，在骨細(xì)胞中表達(dá)較高，細(xì)胞形態(tài)與HE染色結(jié)果相似，見(jiàn)圖3。

2.4 ALP免疫組化染色結(jié)果 ALP免疫組化染色結(jié)果呈棕黃色，由染色結(jié)果可見(jiàn)，成骨細(xì)胞的ALP活性顯著高于骨細(xì)胞，見(jiàn)圖4，此結(jié)果與Van der Plas等[7]報(bào)道相同。

2.5 ALP活性檢測(cè)結(jié)果 骨細(xì)胞ALP活性低于成骨細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

圖3 成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中骨鈣素免疫熒光染色結(jié)果(×40)

A.成骨細(xì)胞；B.骨細(xì)胞

圖4 成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中堿性磷酸酶免疫組化結(jié)果(偶氮偶合染色×20)

A.成骨細(xì)胞；B.骨細(xì)胞

2.6 BGP和Ⅰ型膠原定量分析 使用Image-Pro plus 6.0軟件分別對(duì)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的BGP分泌量和Ⅰ型膠原分泌量灰度值進(jìn)行掃描測(cè)定得知，在骨細(xì)胞中BGP相對(duì)光密度值明顯高于成骨細(xì)胞，而成骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原的相對(duì)光密度值明顯高于骨細(xì)胞，見(jiàn)表2。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，成骨細(xì)胞中BGP表達(dá)低于骨細(xì)胞，而成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)量高于骨細(xì)胞(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

表1 成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶檢測(cè)結(jié)果

注：D(λ)520為吸光值；bP<0.01

表2 成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞中骨鈣素與Ⅰ型膠原相對(duì)光密度值比較

注：bP<0.01

A B

圖5 成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中骨鈣素與Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種老年人易發(fā)的疾病，研究表明，外力作用于骨細(xì)胞會(huì)影響骨組織的形態(tài)及密度，在骨質(zhì)疏松中缺乏機(jī)械刺激和骨密度降低密切相關(guān)[8]。成骨細(xì)胞作為骨細(xì)胞的前體，在骨重建中發(fā)揮著重要作用，多年來(lái)對(duì)骨代謝的研究多以成骨細(xì)胞為基礎(chǔ)[9]，而忽略了對(duì)骨細(xì)胞的深入研究。目前對(duì)于骨細(xì)胞研究主要集中于以下幾方面：①骨細(xì)胞是礦化骨基質(zhì)中的唯一細(xì)胞，其不僅是骨的結(jié)構(gòu)成分，并可作為內(nèi)分泌細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性[10]，調(diào)節(jié)著骨骼的塑形過(guò)程。②骨細(xì)胞作為力的感應(yīng)細(xì)胞，可以感受多種外界機(jī)械性信號(hào)[11]。③骨細(xì)胞是如何將外界機(jī)械性信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)在化學(xué)信號(hào)的，如物理刺激后骨細(xì)胞內(nèi)前列腺素(PEG2)、環(huán)腺苷酸(cAMP)和一氧化氮(NO)等含量的改變[12-13]。

在骨骼轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，由于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量較少且分布在骨組織表面。而骨細(xì)胞的數(shù)量占到骨組織細(xì)胞數(shù)量的95%，并且在成熟的骨組織內(nèi)。因此骨細(xì)胞在時(shí)間和空間上會(huì)發(fā)出指令決定進(jìn)行補(bǔ)充哪種細(xì)胞，是進(jìn)行破骨細(xì)胞的吸收還是進(jìn)行成骨細(xì)胞的骨形成過(guò)程[14]，骨細(xì)胞均勻分布在礦化的骨基質(zhì)中并形成了相互交聯(lián)的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)骨組織受力后會(huì)導(dǎo)致骨陷窩-微管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的細(xì)胞間質(zhì)液流動(dòng)，從而對(duì)骨細(xì)胞產(chǎn)生一種力學(xué)信號(hào)[15-16]。近期研究表明骨細(xì)胞有傳遞應(yīng)力的作用，因此可以作為外界應(yīng)力的感應(yīng)器。外界流體刺激骨細(xì)胞可釋放PEG2，還可產(chǎn)生較高的NO[17-18]，NO具有影響破骨細(xì)胞的形成和活性的功能，從而降低骨吸收能力[19]。此外，還有cAMP、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1、鈣離子、三磷酸腺苷等也可能會(huì)參與。但是目前對(duì)于骨細(xì)胞受外界刺激產(chǎn)生哪種特異生物化學(xué)信號(hào)及骨細(xì)胞受力的主要作用機(jī)制還不太明確，以及骨細(xì)胞是如何將這些力學(xué)刺激在細(xì)胞中轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)并傳遞到其他細(xì)胞中去的。對(duì)于上述問(wèn)題的研究，需要我們分離出較純的骨細(xì)胞。大鼠成骨細(xì)胞的分離技術(shù)目前已比較成熟[20]，在此基礎(chǔ)上，本文建了穩(wěn)定地從大鼠顱骨中分離骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的方法。

成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞成熟礦化的過(guò)程中，會(huì)伴有一些標(biāo)志性指標(biāo)的改變，這就為我們對(duì)骨細(xì)胞的研究提供了基礎(chǔ)[21-22]，如ALP是骨形成過(guò)程的早期產(chǎn)物，其表達(dá)增加說(shuō)明骨形成處于活躍期，但隨著成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，ALP活性下降。這種標(biāo)志性蛋白還有BGP、Ⅰ型膠原、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1[23]等，本研究利用免疫組化染色、免疫熒光化學(xué)染色和Western blot等方法對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中ALP、BGP、Ⅰ型膠原的表達(dá)存在明顯差異，可以作為今后骨細(xì)胞鑒定的成熟指標(biāo)。

前期我們以成骨細(xì)胞為研究基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物及電磁場(chǎng)等都能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟礦化，為抗骨質(zhì)疏松癥新方法的研究做出了貢獻(xiàn)，而骨細(xì)胞作為骨代謝的調(diào)控者，為我們對(duì)黃酮類(lèi)化合物以及電磁場(chǎng)的抗骨質(zhì)疏松癥的研究開(kāi)辟了新途徑。

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Isolation and Identification and Comparative Study of Calvarial Osteoblasts and Osteocytes of Rats

XIE Yan-fang， CHEN Ke-ming, MA Xiao-ni， SHI Wen-gui， ZHOU Jian

(Osteology Institution, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To discuss methods of isolation and purity of rats' calvarial osteoblasts and osteocytes, and to respectively compare the cellular morphous， the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the expression of osteoblast specific protein. Methods Osteoblasts and osteocytes were isolated from skull tissues of neonatal SD rats using sequential collagenase and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) digestion. The cells were identified with hematoxylin and eosin (HE), immunohistochemistry of collagen Ι and immunofluorescence of osteocalcin (BGP) staining. ALP of the two kinds of cells were stained using azo and coupling method, and the activity was detected. Expressions of collagen Ι and BGP of the two kinds of cells were examined by Western blotting. Results The cell morphology after HE staining showed that osteocytes were star-shaped or dendrite-shaped within more dendrites, while osteoblasts were spindle-shaped with less dendrites. Immunohistochemistry staining and Western blotting showed that BGP expression was low in osteoblasts, while the expression was high in osteocytes. The results of fluorescence and HE staining were similar. ALP staining showed that osteoblast had a high expression in osteoblasts, and a low expression in osteocytes. The results of activity detection and staining of ALP were similar. Conclusion The pure calvarial osteocytes and osteoblasts in rats can be isolated by sequential collagenase and EDTA digestion. Osteocytes and osteoblasts may be identified, purified and studied using methods of HE, immunohistochemistry and immunofluorescence staining and Western blotting.

Osteocytes; Osteoblasts; Immunohistochemistry; Collagen Ι; Osteocalcin； Rats， Sprague-Dawley

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270963，81471090)

730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所

陳克明，E-mail：chenkm@lut.cn

R329.2

A

2095-140X(2015)03-0001-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.001

2014-08-15 修回時(shí)間：2014-11-28)