eIF-4A在不同宮頸組織中的表達(dá)及其臨床意義

桑昌美，馬德花，朱德璋，隋愛(ài)華，趙淑萍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 婦科； 2 麻醉科； 3 中心實(shí)驗(yàn)室)

?

eIF-4A在不同宮頸組織中的表達(dá)及其臨床意義

桑昌美1，馬德花1，朱德璋2，隋愛(ài)華3，趙淑萍1

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 婦科； 2 麻醉科； 3 中心實(shí)驗(yàn)室)

目的 探討真核細(xì)胞起始因子4A (eIF-4A)在不同宮頸組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR以及Western-blot方法，檢測(cè)30例正常宮頸組織、26例低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、25例高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及44例宮頸癌組織中eIF-4A mRNA及蛋白的表達(dá)情況，并分析宮頸癌組織中eIF-4A的表達(dá)與其臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果 與正常宮頸組織相比，eIF-4A蛋白及mRNA在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸癌組織中的表達(dá)量逐漸增高，4組間比較差異有顯著性(F=11.07、14.17，P<0.05)；宮頸癌組織中eIF-4A mRNA及蛋白的表達(dá)與其組織學(xué)分級(jí)、是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(F=20.03、19.77，t=7.99、5.38，P<0.05)。結(jié)論 eIF-4A的在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及宮頸癌組織高表達(dá)，提示eIF-4A在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起一定的作用，有可能成為判斷宮頸癌發(fā)生及預(yù)后的分子標(biāo)志之一。

真核細(xì)胞起始因子4A；宮頸腫瘤；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；預(yù)后

宮頸癌是女性第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。近年來(lái)，宮頸癌發(fā)病率明顯增高且發(fā)病年齡呈低齡化趨勢(shì)。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生的最危險(xiǎn)因素[2]。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。真核細(xì)胞起始因子4A(eIF-4A)是DEAD盒家族的一員[3]，具有RNA依賴的ATP酶和RNA解螺旋酶活性，在蛋白合成的起始過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，eIF-4A與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是細(xì)胞增殖和癌變的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)[4-6]。有關(guān)eIF-4A與宮頸癌關(guān)系的研究較少。本文探討eIF-4A在不同宮頸組織中的表達(dá)及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年9月—2012年8月在我院行宮頸活檢或手術(shù)治療病人的標(biāo)本，其中低度上皮內(nèi)瘤變組織(CINⅠ級(jí))26例，高度CIN組織(CINⅡ～Ⅲ級(jí))25例，宮頸癌組織44例，以及同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)后病理證實(shí)為正常宮頸組織30例。所有病人術(shù)前未行放、化療，臨床和病理資料完整。宮頸癌病人年齡24～65歲，中位年齡43歲；宮頸癌組織學(xué)分級(jí)：高分化(G1)12例，中分化(G2)14例，低分化(G3)18例；臨床分期:ⅠB1-B2期23例，ⅡA期21例；病理類型：鱗癌27例，非鱗癌17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。

1.2 試劑及來(lái)源

兔抗人eIF-4A多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；SP免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB染色劑、山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒Trizol Reagant及PrimeScriptTMRTreagent Kit(Perfect Real Time)購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 標(biāo)本處理

所有宮頸組織標(biāo)本離體后切成直徑3～5 mm的組織塊裝入無(wú)RNA酶的EP管中，立即放入液氮中，后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)方法檢測(cè)eIF-4A mRNA的表達(dá) 取50～100 mg組織按照說(shuō)明書(shū)要求的步驟提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，取2 μL進(jìn)行Real-time PCR。eIF-4A上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；GAPDH上游引物:5′-CTGAAGCACCACATATTG-3′，下游引物：5′-CAACACAACCTGAATACTT-3′。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增效率和管家基因的擴(kuò)增效率一致，采用△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.4.2 Western-blot方法檢測(cè)eIF-4A蛋白的表達(dá)取50～100 mg組織，加入RIPA蛋白裂解液，研磨離心后取上清液，置于-20 ℃保存。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行蛋白變性。取等量變性蛋白在100 g/L的PAGE凝膠上電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗4 ℃過(guò)夜。漂洗后加入二抗孵育，再次漂洗后進(jìn)行顯影。采用Quantity-One 4.6.2軟件進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果以每條帶所占比例進(jìn)行表示。

2 結(jié) 果

2.1 Real-time PCR及Western-blot方法檢測(cè)不同宮頸組織中eIF-4A mRNA及蛋白的表達(dá)eIF-4A mRNA在正常宮頸、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸癌組織相對(duì)表達(dá)量分別為1.00、1.22、1.27、2.27,4組比較差異有顯著性(F=11.07，P<0.05)。eIF-4A蛋白在正常宮頸、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸癌組織的相對(duì)表達(dá)量分別為17.33±1.67、18.19±1.62、23.86±2.93、25.17±2.30，4組間比較差異有顯著性(F=14.17，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 宮頸癌組織中eIF-4A mRNA及蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

eIF-4A mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量與宮頸癌組織學(xué)分級(jí)及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(F=20.03、19.77，t=7.99、5.38，P<0.05)；而與組織病理類型和臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

eIF-4F是由eIF-4A、eIF-4E和eIF-4G組成的三聚體。eIF-4F與真核細(xì)胞mRNA的帽狀結(jié)構(gòu)的結(jié)合是蛋白翻譯的起始。eIF-4E能夠識(shí)別并且直接結(jié)合于帽狀結(jié)構(gòu)，將mRNA和40S核糖體連結(jié)起來(lái)，并作為支架蛋白與eIF-4A、eIF-4E相互作用。在40S核糖體募集之后，eIF-4F結(jié)合到帽狀結(jié)構(gòu)上，形成的43S起始前復(fù)合物開(kāi)始掃描5′-端非翻譯區(qū)(5′-UTR)，直到起始密碼子的出現(xiàn)。eIF-4A是eIF-4F復(fù)合物中含量最多的起始因子，它是一種ATP依賴的RNA解螺旋酶、ATP依賴性RNA結(jié)合蛋白，能夠打開(kāi)mRNA 5′非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)核糖體的結(jié)合。

①正常宮頸組織，②CINⅠ組織，③CINⅡ～Ⅲ組織，④宮頸癌組織。

表1 宮頸癌組織中eIF-4A mRNA及蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

研究顯示，起始因子生理限制的解除可以導(dǎo)致癌基因蛋白合成增加。而對(duì)eIF-4A翻譯起始調(diào)控敏感的基因包括許多的原癌基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如MYC、MYB、NOTCH、CDK6、BCL2等[7]。eIF-4A mRNA在黑色素瘤組織表達(dá)量是正常黑色素細(xì)胞的5倍[4]。本研究結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，eIF-4A在正常宮頸、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ及宮頸癌組織中的表達(dá)量逐漸升高。將eIF-4A基因敲除以及eIF-4A主要結(jié)構(gòu)體的突變均可以抑制蛋白的合成[8]；而在體外，加入eIF-4A拮抗劑也可抑制腫瘤的發(fā)生[9]。eIF-4A在上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸癌組織中表達(dá)量增多，提示其表達(dá)的升高是宮頸癌發(fā)生的早期事件，可能參與了宮頸癌的發(fā)展過(guò)程。因此，eIF-4A可作為判斷宮頸癌發(fā)生的可靠指標(biāo)。

目前，明確判斷宮頸癌預(yù)后的有效因素主要是盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而其他臨床病理因素對(duì)預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后亦有重要價(jià)值，如腫瘤病理類型、臨床分期、分化級(jí)別、肌層浸潤(rùn)深度、脈管內(nèi)瘤栓轉(zhuǎn)移情況及手術(shù)切緣均可能與宮頸癌預(yù)后相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)亦檢測(cè)eIF-4A在宮頸癌組織中的表達(dá)量，并分析其與部分臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，宮頸癌組織學(xué)分級(jí)越低，惡性程度越高，eIF-4A的表達(dá)量越高。癌組織的惡性程度越高，則細(xì)胞生長(zhǎng)速度越快，所需蛋白合成的速度越快、數(shù)量越多。盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的eIF-4A表達(dá)水平明顯高于無(wú)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌最主要轉(zhuǎn)移方式。eIF-4A表達(dá)與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。說(shuō)明淋巴結(jié)是eIF-4A分子的重要靶點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)提高eIF-4A的表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴管的生成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而，在本研究中，eIF-4A的表達(dá)與其臨床分期無(wú)明顯關(guān)系。在臨床上，只有ⅠB1～ⅡA期的宮頸癌病人才能直接接受手術(shù)治療，且本研究中宮頸癌組織標(biāo)本相對(duì)較少，可能對(duì)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。宮頸癌中eIF-4A的表達(dá)量與其組織病理類型無(wú)關(guān)，這可能是由于不管是鱗狀細(xì)胞癌還是非鱗狀細(xì)胞癌，細(xì)胞均已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，蛋白的合成的速度均較快、合成的量均較多，故彼此之間無(wú)明顯差異。因此，eIF-4A有望成為判斷宮頸癌預(yù)后的分子標(biāo)志之一。

[1] JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] WALBOOMERS J M, JACOBS M V, MANOS M M, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. J Pathol, 1999,189(1):12-19.

[3] LINDER P, LASKO P F, ASHBURNER M, et al. Birth of the D-E-A-D box[J]. Nature, 1989,337(623):121-122.

[4] EBERLE J, KRASAGAKIS K, ORFANOS C E. Translation initiation factor eIF-4A1 mRNA is consistently overexpressed in human melanoma cells in vitro[J]. Int J Cancer, 1997,71(3):396-401.

[5] SHUDA M, KONDOH N, TANAKA K, et al. Enhanced expression of translation factor mRNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Anticancer Res, 2000,20(4):2489-2494.

[6] LIN Y W, APLAN P D. Gene expression profiling of precursor T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma identifies oncogenic pathways that are potential therapeutic targets[J]. Leukemia, 2007,21(6):1276-1284.

[7] WOLFE A L, SINGH K, ZHONG Y, et al. RNA G-quadruplexes cause eIF4A-dependent oncogene translation in cancer[J]. Nature, 2014,513(7516):65-70.

[8] SVITKIN Y V, PAUSE A, HAGHIGHAT A, et al. The requirement for eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A) in translation is in direct proportion to the degree of mRNA 5′ secondary structure[J]. RNA, 2001,7(3):382-394.

[9] GALICIA-VAZQUEZ G, CENCIC R, ROBERT F, et al. A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AⅡ transcription[J]. RNA, 2012,18(7):1373-1384.

[10]劉薇,王言奎,楊慧英,等. 宮頸癌組織NDRG1與P16蛋白表達(dá)及其意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2012,27(4):309-310,313.

(本文編輯 厲建強(qiáng))

EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF EIF-4A IN DIFFERENT CERVICAL TISSUES

SANGChangmei,MADehua,ZHUDezhang,SUIAihua,ZHAOShuping

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expression of eIF-4A in different cervical tissues and its clinical significance.MethodsEmploying quantitative real-time PCR and Western-blot analysis, the expression of eIF-4A mRNA in normal cervical tissue (N,n=30), low-grade cervical intraepithelial neoplasia (CINⅠ,n=26), high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CINⅡ-Ⅲ,n=25) and cervical cancer (CA,n=44) was detected.ResultsCompared with the group of normal cervical tissue, the expressions of eIF-4A mRNA and protein gradually increased in the order of groups CINⅠ, CINⅡ-Ⅲ and CA (F=11.07,14.17;P<0.05). In cervical cancer tissue, the expressions of eIF-4A mRNA and protein were correlated with the histological grade and lymphatic metastasis (F=20.03,19.77;t=7.99,5.38;P<0.05).ConclusionThe high expression of eIF-4A in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer indicates that eIF-4A plays a certain role in the oncogenesis of cervical cancer, and it may become one of prognostic biomarkers in cervical cancer.

eukaryotic initiation factor-4A; uterine cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia; prognosis

2015-02-11;

2015-05-27

桑昌美(1989-)，女，碩士研究生。

趙淑萍(1966-)，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。

R737.33

A

1008-0341(2015)04-0462-03