鼻咽癌和健康人群中EB病毒BARF0基因序列分析

王偉娜，高翔翔，沈智超，羅兵，王云

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，山東 青島 266021；2 中國人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院檢驗(yàn)科； 3 青島市城陽區(qū)流亭衛(wèi)生院)

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鼻咽癌和健康人群中EB病毒BARF0基因序列分析

王偉娜1，2，高翔翔3，沈智超1，羅兵1，王云1

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，山東 青島 266021；2 中國人民解放軍濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院檢驗(yàn)科； 3 青島市城陽區(qū)流亭衛(wèi)生院)

目的 了解山東地區(qū)鼻咽癌(NPC)及健康人群中EB病毒(EBV)編碼BARF0基因變異特征，探討其變異意義。方法 采用PCR和DNA測序檢測NPC組織以及健康成年人咽漱液標(biāo)本中EBV的BARF0基因序列，與EBV標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比較，根據(jù)特征性突變對變異進(jìn)行分類。結(jié)果 73例NPC病人和70例健康人群BARF0成功測序，共檢出4處共有突變。其中36例(49.3%)NPC和29例(41.4%)健康人群同時(shí)出現(xiàn)4處共有突變(T160473G、T160545C、A160701C和C160707G)，被分類為4M變異型；35例(48.0%)NPC和38例(54.3%)健康人群同時(shí)出現(xiàn)除T160473G外的3處共有突變，被分類為3M變異型，其余2例(2.7%)NPC和3例(4.3%)健康人群分類為Others。χ2檢驗(yàn)精確概率法分析表明,BARF0變異型在2種人群中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.618)。結(jié)論 山東地區(qū)NPC和健康人群中EBV毒株BARF0序列變異一致，BARF0基因變異的地域性分布及與EBV相關(guān)腫瘤的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

皰疹病毒4型,人；染色體結(jié)構(gòu)變異；BARF0基因；鼻咽腫瘤

EB病毒(EBV)與多種人類淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[1]。EBV BamHI A右向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(BARTs)是EBV的一組選擇性剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在最后一個(gè)外顯子3′末端均含有一個(gè)共同的開放讀碼框BARF0。BARTs在所有EBV相關(guān)腫瘤組織中表達(dá)，有研究表明其可通過維持病毒潛伏感染或作為非編碼RNA參與EBV致癌過程[2-3]。雖然EBV廣泛分布于世界各地，但是鼻咽癌(NPC)等EBV相關(guān)腫瘤存在明顯的地域性，因此，尋找可能與腫瘤相關(guān)的EBV變異株一直是研究的熱點(diǎn)之一，但某一特定的EBV基因亞型代表地域相關(guān)性變異還是疾病相關(guān)性變異尚存在著爭議[4]。目前，有關(guān)BARTs基因多態(tài)性的研究報(bào)道較少[5-6]。本研究檢測山東地區(qū)NPC病人和健康人群中BARF0基因序列，探討其變異意義，旨在為深入分析BARF0基因變異與腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其生物學(xué)功能提供依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集及DNA提取

NPC石蠟包埋組織取自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科，通過原位雜交檢測組織標(biāo)本中EBV編碼小RNA1鑒定EBV陽性NPC組織標(biāo)本，具體步驟參見文獻(xiàn)的方法[7]。咽漱液(TW)標(biāo)本取自健康查體人員，通過PCR檢測EBV BamHI W片段篩選和鑒定EBV陽性TW標(biāo)本[8]。所有病例和健康人群來自相同地區(qū)，包括山東省多個(gè)地區(qū)，其祖籍均為山東且居住在山東的當(dāng)?shù)厝巳骸２捎肍FPE石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取石蠟包埋組織DNA，使用酚-氯仿-異戊醇法常規(guī)提取新鮮組織和TW標(biāo)本DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增

BARF0位于BARTs 3′末端，長525 bp(B85-8 coodinates 160470-160994)，推測編碼含174個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8(GenBank收錄號：V01555)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增BARF0基因的巢式PCR引物，引物序列、在基因組中的位置及擴(kuò)增片段大小見表1。其中P1和P2為外巢PCR引物，P3和P4為內(nèi)巢PCR引物。外巢PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10×Buffer 2.0 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L，高保真Taq DNA聚合酶(大連TaKaRa公司)1.0 U，DNA 模板100 ng；取外巢PCR產(chǎn)物1 μL為內(nèi)巢PCR模板，反應(yīng)體積為30 μL。循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；然后，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取3 μL的 PCR產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并鑒定。

表1 BARF0基因序列分析所用引物

1.3 DNA測序

取25 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司，采用末端終止法進(jìn)行雙向測序，測序引物為內(nèi)巢PCR引物。測序結(jié)果用Chromas軟件查看峰圖文件，用DNAStar軟件(Lasergene，version 7.0)剪接序列和對排分析，以EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8序列作為參比序列，同時(shí)與基因庫中相關(guān)序列進(jìn)行對比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以PPMS 1.5[9]軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)精確概率法分析BARF0基因變異類型在NPC和健康人群之間分布的差異。以P<0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 BARF0基因序列多態(tài)性

共有73例NPC和70例健康人群標(biāo)本完成測序。與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8比較，所有序列均出現(xiàn)變異，均為單核苷酸突變，其變異情況見圖1。共檢出22處突變，組成16種DNA序列，其中4處突變見于較多樣本，屬共有突變，其余18處突變均為見于1～3例樣本的散在突變。4處共有突變中，C160707G(2例為T160707G)見于所有的樣本中，T160545C和A160701C同時(shí)出現(xiàn)于幾乎所有的樣本(96.5%，138/143)，而T160473G突變則僅見于部分的樣本(45.5%，65/143)。根據(jù)4處共有突變對BARF0基因變異進(jìn)行分類，將同時(shí)出現(xiàn)上述4處共有突變的序列分類為4M變異型，共同出現(xiàn)其中3處共有突變(T160545C、A160701C和C160707G)的序列分類為3M變異型。2種變異型樣本中，多數(shù)樣本僅具有共有突變，部分樣本還伴有其他位點(diǎn)的散在突變。有5例樣本除共有突變C160707G(或T160707G)外，未出現(xiàn)其他3處共有突變，但伴有其他位點(diǎn)的散在突變，分類為Others。

圖1中同時(shí)列出了GenBank中已經(jīng)完整測序的19株EBV BARF0基因序列，來源于我國NPC高發(fā)區(qū)NPC的13株EBV毒株(GD1、GD2、M81、C666-1、HKNPC1-HKNPC9，GenBank基因收錄號分別為：AY961628、HQ020558、KF373730、KJ411974、JQ009376、KF992564-KF992571)[10-13]和另外來源于日本BL的Akata(KC207813)[14]均為4M變異型；而來源于非洲Burkitt淋巴瘤(BL)的AG876(DQ279927)[15]則為3M變異型，另外MUTU(KC207814)[14]只出現(xiàn)A160701C和C160707G的2處共有突變和1處散在突變，將其歸類為Others；來自美國健康成人的K4413Mi和K4123Mi(KC440852和KC440851)[16]與來自美國傳染性單核細(xì)胞增多癥的EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8一致。

2.2 BARF0基因變異類型在NPC及健康人群中的分布

NPC和健康人群中BARF0基因變異類型的分布見表2。多數(shù)樣本為3M變異型和4M變異型，少數(shù)為Others。BARF0變異類型在2種人群中構(gòu)成比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.618)。

表2 BARF0基因變異類型在NPC和健康人群中的分布

陰影中序列表示4M和3M變異型的共有序列，每一種序列以1例樣本名稱表示，括號中的數(shù)字表示來自NPC和健康人群與該樣本序列相同的樣本數(shù)量，N：NPC；T：健康人群。GenBank中已測序毒株以斜體表示，包括HKNPC1-HKNPC9、GD1、GD2、M81、C666-1、Akata、AG876、MUTU、B95-8、K4413Mi和K4213[11-17]。

3 討 論

本研究對山東地區(qū)73例NPC和73例健康人群中EBV BARF0基因進(jìn)行序列多態(tài)性分析。與B95-8比較，所有標(biāo)本BARF0基因均出現(xiàn)單核苷酸突變，無插入和缺失，BARF0基因出現(xiàn)的突變位點(diǎn)少，且不同樣本之間變異較為一致。共檢出4處共有突變，其中C160707G(或T160707G)、T160545C和A160701C同時(shí)出現(xiàn)于幾乎所有樣本(124/127)。目前僅有廣州地區(qū)20例NPC組織和19株完成測序的EBV毒株可獲知其BARF0序列，其中廣州地區(qū)20例NPC組織[6]、來源于廣東和香港NPC的13株EBV毒株[10-13]、來源于日本BL的Akata毒株和非洲BL的AG876[14-15]均同時(shí)出現(xiàn)該3處突變，提示該3處突變是BARF0基因的突變熱點(diǎn)。

與上述3處突變不同，T160473G僅見于部分樣本，根據(jù)其出現(xiàn)與否，將所檢測樣本中BARF0基因分為4M和3M兩種主要變異類型。兩種變異型在NPC和健康人群中的分布無顯著性差異，提示BARF0變異可能與山東地區(qū)NPC發(fā)生的易感性無相關(guān)性。但值得關(guān)注的是，來自NPC高發(fā)區(qū)的所有20例NPC和13株來源于NPC的EBV毒株均為4M變異型[6,10-13]，而4M變異型在山東地區(qū)NPC病人和健康人群中檢出率分別為49.3%(36/73)和41.4%(29/70)，提示4M變異型在高發(fā)區(qū)NPC具有更高的檢出率。以往有研究表明，EBV其他潛伏期基因如潛伏膜蛋白1的China 1亞型或核抗原1的V-val亞型在高發(fā)區(qū)NPC的檢出率高于同一地區(qū)健康人群，認(rèn)為它們與NPC的發(fā)生相關(guān)[4,17]。但有研究顯示，China 1或V-val在NPC和健康人群中檢出率類似，認(rèn)為它們與NPC發(fā)生無關(guān)[4]。張琳琳等[5]研究顯示，BARTs A73基因A157154 C突變在廣東地區(qū)NPC中的檢出率高于健康人群。由于目前尚缺乏來自NPC高發(fā)區(qū)正常人群及其他地域NPC和非NPC人群BARF0基因多態(tài)性的報(bào)道，BARF0 4M變異型毒株是否在高發(fā)區(qū)NPC中流行及與NPC的相關(guān)性，需要進(jìn)一步采集不同地區(qū)樣本及擴(kuò)大檢測樣本例數(shù)證實(shí)。

BARTs的功能尚未明確，但由于其在EBV相關(guān)腫瘤組織中普遍表達(dá)，尤其在上皮性腫瘤中呈高表達(dá)，推測其在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮作用[1-2]，其可能反義調(diào)節(jié)互補(bǔ)鏈裂解期基因的表達(dá)參與維持病毒的潛伏感染[1-2]，可能作為長鏈非編碼RNA而起作用[3]，BARTs體外表達(dá)的某些蛋白如RK-BARF0可以通過與Notch相互作用誘導(dǎo)EBV致癌基因潛伏膜蛋白1的表達(dá)[18]。本研究4處共有突變在推測的BARF0蛋白中均引起氨基酸突變。由于對該基因功能、作用機(jī)制、基因結(jié)構(gòu)等了解較少，因而現(xiàn)在還難以預(yù)測這些變異對其功能的影響。BARF0變異的研究，對明確BARF0基因變異的地域分布、與EBV相關(guān)腫瘤的關(guān)系及生物學(xué)意義具有指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步明確EBV基因變異與腫瘤的相關(guān)性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯 張蓓 于國藝)

SEQUENCE ANALYSIS OF BARF0 GENE OF EPSTEIN-BARR VIRUS IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA AND HEALTHY CROWD

WANGWeina,GAOXiangxiang,SHENZhichao,LUOBing,WANGYun

(Department of Microbiology, Qing-dao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the characteristics of polymorphisms of BARF0 gene of Epstein-Barr virus (EBV) in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and healthy crowd of Shandong province, and explore the significance of BARF0 gene variations.MethodsEmploying PCR and DNA sequencing, the BARF0 sequences of isolates from NPC biopsies and throat washing samples of healthy persons were detected. The sequences were compared with the EBV type strain, and the variations were classified according to distinctive mutation.ResultsA total of 143 isolates from 73 NPC and 70 healthy donors were successfully sequenced and four common mutations were detected. Thirty-six (49.3%) NPC and 29 (41.4%) healthy donor isolates with four common mutations (T160473G, T160545C, A160701C and C160707G) were arranged into one group and named variant 4M, and 35 (48.0%) NPC and 38 (54.3%) healthy donor isolates with three common mutations (T160545C, A160701C and C160707G) were characterized into one group and named variant 3M. The remaining two (2.7%) NPC and three (4.3%) healthy donor isolates were classified as “Others” group. Chi-square test showed that the distribution of the BARF0 variants among two population groups was not significantly different (P=0.618).ConclusionThe isolates in NPC and healthy donors in Shandong province demonstrates consistent variation pattern. The geographical distribution of the BARF0 variants and the relationship between BARF0 variation and EBV-associated tumors are worth further study.

herpesvirus 4, human; genomic structural variation; BARF0 gene; nasopharyngeal neoplasms

2015-02-09;

2015-04-23

國家自然科學(xué)基金(81171571)和青島市科技局科研基金(13-1-3-50-nsh)資助項(xiàng)目

王偉娜(1984-)，女，碩士研究生。

王云(1970-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。

R373.9;R739.63

A

1008-0341(2015)04-0383-04