仿生法評定抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米的酶水解物能值的研究

鐘儒清 陳 亮 高理想 黃慶華 劉 蕾 張宏福（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193）

仿生法評定抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米的酶水解物能值的研究

鐘儒清 陳 亮 高理想 黃慶華 劉 蕾 張宏福?
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193）

摘 要:本試驗旨在分析抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米原料及飼糧與同源非轉(zhuǎn)基因玉米原料及飼糧體外總能消化率以及酶水解物能值，為轉(zhuǎn)基因玉米的營養(yǎng)實質(zhì)等同性仿生評定方法的研究提供參考。試驗采用單因素完全隨機設(shè)計，使用單胃動物仿生消化系統(tǒng)模擬飼料原料和飼糧在雞胃腸道的消化過程，分析同源非轉(zhuǎn)基因玉米、抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米以及對應(yīng)的3種玉米－豆粕飼糧在不同體外模擬消化階段的干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值的差異。結(jié)果表明:同源非轉(zhuǎn)基因玉米、抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米以及對應(yīng)飼糧在常規(guī)概率成分含量上是相似的?？共莞熟⒂衩准帮暭Z與同源非轉(zhuǎn)基因玉米及飼糧相比，在干物質(zhì)和能量胃消化率、全消化道消化率及酶水解物能值上均沒有顯著差異（P＞0.05）。轉(zhuǎn)Bt基因玉米全消化道總能消化率低于同源非轉(zhuǎn)基因玉米（P＝0.03，變異系數(shù)＝0.50%），對應(yīng)玉米飼糧的酶水解物能值則高于同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧（P＝0.02，變異系數(shù)＝1.12%），但均處于仿生消化系統(tǒng)測試的誤差范圍內(nèi)（變異系數(shù)≤1.64%）。由此可見，抗草甘膦玉米的酶水解物能值與同源對照玉米沒有差異，而轉(zhuǎn)Bt基因玉米存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，但所有的測值均處于仿生消化系統(tǒng)的測試誤差之內(nèi)。仿生法發(fā)現(xiàn)的差異是否具有生物學(xué)意義有待體內(nèi)試驗驗證。仿生法可為轉(zhuǎn)基因飼料營養(yǎng)等同性研究提供一種新方法。

關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因玉米；干物質(zhì)消化率；總能消化率；酶水解物能值；仿生消化系統(tǒng)

2013年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.752 億hm2，延續(xù)了17年的持續(xù)增長［1］。約八成的轉(zhuǎn)基因作物作為畜禽飼料原料［2］。轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積僅次于轉(zhuǎn)基因大豆，位居第二，而且玉米是畜禽飼糧的主要能量來源。大量文獻研究表明轉(zhuǎn)基因玉米對畜禽營養(yǎng)、免疫、繁殖、腸道微生態(tài)等多個方面沒有產(chǎn)生不利的影響［2－6］。在轉(zhuǎn)基因玉米飼用安全的前提下，轉(zhuǎn)基因玉米的養(yǎng)分的營養(yǎng)價值評定對玉米的利用具有重要的意義。動物試驗表明，轉(zhuǎn)基因玉米與同源非轉(zhuǎn)基因玉米營養(yǎng)成分和消化率沒有顯著差異，具有營養(yǎng)實質(zhì)等同性［4，7］。動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室開發(fā)的單胃動物仿生消化系統(tǒng)（SDS?Ⅱ）試圖通過模擬飼料在豬禽體內(nèi)的消化過程，實現(xiàn)對飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價的估測。本課題組長期從事基于體外酶法的仿生方法研究和仿生消化系統(tǒng)的開發(fā)，由電腦程控模型控制模擬飼料在畜禽體內(nèi)消化過程，最大限度地減少了由于人工操作產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，測試的酶水解物能值（enzymatic hydrolysate gross ener?gy，EHGE）與動物體內(nèi)能值具有較高的相關(guān)性和重演性［8－10］。但利用體外法評價轉(zhuǎn)基因飼料的酶水解物能值仍鮮見相關(guān)報道。本文利用仿生消化系統(tǒng)體外評價抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米以及飼糧的干物質(zhì)消化率（dry matter digestibility，DMD）、總能消化率（gross energy digestibility，GED）和酶水解物能值，為仿生消化方法評價轉(zhuǎn)基因飼料營養(yǎng)等同性提供參考。

1　材料與方法

本試驗于2014年3月到2014年7月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室進行。

1.1 飼料材料

本試驗選用同源非轉(zhuǎn)基因玉米（鄭單958玉米）、抗草甘膦玉米（轉(zhuǎn)maroACC基因玉米）和轉(zhuǎn)Bt基因玉米（轉(zhuǎn)mCry1Ac基因玉米）以及對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因玉米－非轉(zhuǎn)基因豆粕飼糧、抗草甘膦玉米－非轉(zhuǎn)基因豆粕飼糧、轉(zhuǎn)Bt基因玉米－非轉(zhuǎn)基因豆粕飼糧，3種飼糧是參照NRC（1994）蛋雞營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)配制的。2種轉(zhuǎn)基因玉米以及同源非轉(zhuǎn)基因玉米均來自于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家玉米改良中心。飼料原料采用四分法取樣后，用試驗用飼料粉碎機粉碎過60目，充分混合均勻后－20℃儲備備用。飼料原料化學(xué)成分見表1，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用單因素完全隨機設(shè)計。3個玉米原料和3個飼糧共6種試驗樣品，每種樣品設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。

1.3 轉(zhuǎn)基因玉米及飼糧的干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能的測定

用實驗室SDS?Ⅱ仿生消化儀，分別測定樣品在雞胃段和全消化道的干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值。

1.3.1 胃模擬消化期的操作過程

精確稱取2.000 0 g飼料材料（精確到0.000 2 g）到10 mL的試管中。然后配制活性為1 550 U/mL的雞胃蛋白酶液，使用該蛋白酶液20 mL連同飼料樣品無損轉(zhuǎn)移到套有透析袋的仿生消化管中。此過程中同步測定飼料樣品的干物質(zhì)含量。

將仿生消化管固定在已經(jīng)預(yù)熱的SDS?Ⅱ仿生消化儀系統(tǒng)機器上，連通事先配制的胃段緩沖液，41℃條件下消化4 h。消化過程結(jié)束后，將消化殘渣無損轉(zhuǎn)移到已知絕干重量的培養(yǎng)皿中，放在65℃烘箱中烘干至無水痕后，再在105℃條件下烘干至恒重，計算干物質(zhì)消化率。

將培養(yǎng)皿中的消化殘渣全部刮下，轉(zhuǎn)移到絕干的玻璃砂芯坩堝中，無水乙醇脫脂后烘干至恒重，并測定脫脂未消化殘渣的能量值，推算飼料樣品的酶水解物能值。

表1　玉米原料的常規(guī)營養(yǎng)成分含量分析（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Analyzed nutrient composition of corn ingredients（dry matter basis）

1.3.2 全消化道模擬消化期的操作過程

配制含淀粉酶（活性為401.46 U/mL）、胰蛋白酶（活性為49.28 U/mL）、糜蛋白酶（活性為11.31 U/mL）的模擬雞小腸液。在胃段消化結(jié)束時，連通事先配制的小腸前段緩沖液和小腸后段緩沖液，并通過SDS?Ⅱ的加酶管在每個消化管中補加2 mL模擬小腸液，41℃條件下小腸前段消化7.5 h和小腸后段消化7.5 h。其余步驟同胃段消化過程。

透析袋的前處理、緩沖液的配制和儀器運行參數(shù)等試驗操作細(xì)節(jié)均按照《單胃動物仿生消化系統(tǒng)操作手冊》［11］嚴(yán)格進行。

表2　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets（dry matter basis）　%

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

根據(jù)單因素完全隨機設(shè)計，用SAS 9.2對2種轉(zhuǎn)基因玉米及飼糧分別與其同源對照組分別進行成組法t檢驗，用MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進行分析。其中P＜0.05為差異顯著，0.05＜P＜0.10趨勢分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。其中數(shù)據(jù)計算公式如下:

DMD（%）＝［（M1－M2）/M1］×100；

GED（%）＝［（GE1－GE2）/GE1］×100；

EHGE＝（GE1－GE2）/（M1×1 000）。

式中:DMD為飼料體外干物質(zhì)消化率（%）；GED為飼料體外總能消化率（%）；EHGE為飼料體外酶水解物能值（MJ/kg）；M1為上樣飼料干物質(zhì)重量（g）；M2為未消化殘渣干物質(zhì)重量（g）；GE1為上樣飼料總能（J）；GE2為未消化殘渣總能（J）。

腸段的干物質(zhì)消化率、總能消化率為全消化道測值與胃段測值之差。

2　結(jié) 果

2.1 仿生法評定3種玉米原料的干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值

在體外模擬同源非轉(zhuǎn)基因玉米、抗草甘膦玉米和轉(zhuǎn)Bt基因玉米的胃和全消化道消化中（表3），轉(zhuǎn)Bt基因玉米（5.18%）、抗草甘膦玉米（6.01%）與同源非轉(zhuǎn)基因玉米（5.54%）相比在胃干物質(zhì)消化率上均沒有顯著性差異（P＞0.05）。在全消化道干物質(zhì)消化中，轉(zhuǎn)Bt基因玉米干物質(zhì)消化率（78.10%）與非轉(zhuǎn)基因玉米（78.88%）相比沒有顯著性差異（P＞0.05），抗草甘膦玉米干物質(zhì)消化率（77.92%）與非轉(zhuǎn)基因玉米相比則有減小的趨勢（P＝0.06），但兩者極差為2.58%，變異系數(shù)為0.86%。3種玉米腸干物質(zhì)消化率變化范圍為71.91%～73.34%。

2種轉(zhuǎn)基因玉米的胃總能消化率與非轉(zhuǎn)基因玉米相比均沒有呈現(xiàn)出顯著性差異（變化范圍11.35%～11.78%，P＞0.05）。與同源非轉(zhuǎn)基因玉米全消化道總能消化率（84.54%）相比，抗草甘膦玉米的（84.32%）沒有表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05），轉(zhuǎn)Bt基因玉米（83.78%）則顯著低于非轉(zhuǎn)基因玉米（P＝0.03），兩者極差為1.68%，變異系數(shù)為0.50%。3種玉米腸的能量消化率變化范圍則為72.00%～73.15%。2種轉(zhuǎn)基因玉米的酶水解物能值與非轉(zhuǎn)基因玉米相比也沒有顯著差異（變化范圍15.55～15.66 MJ/kg，P＞0.05）。

2.2 仿生法評定3種玉米飼糧的干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值

在體外模擬同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧、抗草甘膦玉米飼糧和轉(zhuǎn)Bt基因玉米飼糧的雞胃和全消化道消化中（表4），轉(zhuǎn)Bt基因玉米飼糧（23.19%）、抗草甘膦玉米飼糧（23.83%）與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧（23.29%）相比在胃干物質(zhì)消化率上均沒有顯著性差異（P＞0.05）。2種轉(zhuǎn)基因玉米飼糧的全消化道干物質(zhì)消化率與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧相比也沒有顯著差異（變化范圍68.30%～68.88%，P＞0.05）。腸的干物質(zhì)消化率變化范圍為45.05%～45.18%。

轉(zhuǎn)Bt基因玉米飼糧（19.57%）、抗草甘膦玉米飼糧（20.66%）與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧（19.58%）相比在胃總能消化率上均沒有顯著性差異（P＞0.05）。2種轉(zhuǎn)基因玉米飼糧的全消化道總能消化率與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧相比也沒有顯著差異（變化范圍70.48%～71.63%，P＞0.05）。腸的能量消化率變化范圍為50.29%～52.06%?？共莞熟⒂衩罪暭Z的酶水解物能值（10.61 MJ/kg）與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧（10.57 MJ/kg）沒有顯著差異（P＞0.05），轉(zhuǎn)Bt基因玉米飼糧的酶水解物能值（10.83 MJ/kg）則顯著高于對照玉米飼糧（P＝0.02），但兩者極差為0.35 MJ/kg，變異系數(shù)為1.12%。

3　討 論

3.1 轉(zhuǎn)基因玉米的營養(yǎng)成分含量分析

轉(zhuǎn)基因玉米飼用安全性評價的第一步即是玉米的營養(yǎng)成分含量分析，也是配制飼糧和開展動物試驗的基礎(chǔ)。本試驗表明抗草甘膦玉米、轉(zhuǎn)Bt基因玉米以及飼糧與同源非轉(zhuǎn)基因玉米原料和飼糧在常規(guī)概率成分含量上具有相似性。這與文獻報道的轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米常規(guī)概率成分含量相似一致［4，12－14］。Walsh等［15］分析表明轉(zhuǎn)Bt基因玉米和同源非轉(zhuǎn)基因玉米除了在酸性洗滌纖維和抗性淀粉含量在數(shù)值上增加外，其他概率成分和氨基酸組成上具有相似性。Mcnaughton等［16］也發(fā)現(xiàn)抗草甘膦玉米與其同源非轉(zhuǎn)基因玉米具有相似的營養(yǎng)成分。轉(zhuǎn)基因玉米在與同源非轉(zhuǎn)基因玉米的常規(guī)概率成分含量上具有相似性，同時部分養(yǎng)分?jǐn)?shù)值上也存在微小差異，這種微小的差異是否會影響轉(zhuǎn)基因玉米以及飼糧的養(yǎng)分效價，本研究使用體外干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值作進一步的測試與分析。

3.2 轉(zhuǎn)基因玉米養(yǎng)分效價評定

從玉米原料及飼糧的仿生消化率測試看，與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧相比，抗草甘膦玉米飼糧在各消化段的干物質(zhì)消化率、能量消化率和酶水解物能值均沒有顯著性差異。與同源非轉(zhuǎn)基因玉米相比，抗草甘膦玉米原料的能量消化率和酶水解物能值均沒有差異，而全消化道干物質(zhì)消化率在測值上有降低的趨勢；而轉(zhuǎn)Bt基因玉米及飼糧與對照玉米及飼糧間的變異系數(shù)均處在SDS?Ⅱ的精度范圍之內(nèi)（變異系數(shù)≤1.64%），統(tǒng)計意義上的下降的趨勢可能來源于仿生消化系統(tǒng)本身的測試誤差。

表3　玉米原料干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值Table3DrymatterandgrossenergydigestibilityandEHGEofcorningredients %

表4　玉米飼糧干物質(zhì)消化率、總能消化率和酶水解物能值Table4DrymatterandgrossenergydigestibilityandEHGEofcorndiets %

豬的消化試驗表明與對照非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧相比，抗草甘膦玉米飼糧的養(yǎng)分（有機物、粗蛋白質(zhì)、無氮浸出物）消化率、消化能以及代謝能均沒有差異［17］。Aulrich等［18］進行的轉(zhuǎn)Bt基因玉米養(yǎng)分效價評定研究中，飼喂轉(zhuǎn)基因玉米飼糧的肉雞、蛋雞及豬等的主要養(yǎng)分消化率和代謝能均沒有顯著性差異。Reuter等［19］的研究表明轉(zhuǎn)Bt基因玉米與常規(guī)玉米在化學(xué)成分上、常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)消化率以及總能消化率上均沒有出現(xiàn)顯著性差異。本試驗結(jié)果顯示與同源非轉(zhuǎn)基因玉米飼糧相比轉(zhuǎn)Bt基因玉米干物質(zhì)消化率沒有差異，但全消化道總能消化率低于同源對照玉米，而對應(yīng)的轉(zhuǎn)Bt基因玉米飼糧的酶水解物能值卻高于對照玉米飼糧?？赡艿脑蚴菃挝竸游锓律到y(tǒng)的體外干物質(zhì)和能量消化率及酶水解物能值的變異系數(shù)為1.64%［20］，而本試驗測定的轉(zhuǎn)Bt基因玉米及飼糧與對照玉米及飼糧間的差異均處在SDS?Ⅱ的精度范圍之內(nèi)（變異系數(shù)≤1.64%）；同時，轉(zhuǎn)Bt基因玉米具有較低的總能消化率，而轉(zhuǎn)Bt基因玉米飼糧卻具有較高的酶水解物能值，這種看似不一致的測試結(jié)果也進一步說明了統(tǒng)計意義上的差異可能來源于仿生消化系統(tǒng)本身的測試誤差。目前，大量動物試驗表明轉(zhuǎn)Bt基因玉米和抗草甘膦玉米在養(yǎng)分效價上與同源非轉(zhuǎn)基因玉米具有營養(yǎng)等同性，但動物個體差異很大，有時可能會掩蓋或者削弱養(yǎng)分效價的差異。高精度的仿生法可初步評估轉(zhuǎn)基因飼料的養(yǎng)分效價，成為轉(zhuǎn)基因飼料評價的新手段。

4　結(jié) 論

與非轉(zhuǎn)基因玉米相比，抗草甘膦玉米的酶水解物能值沒有差異，而轉(zhuǎn)Bt基因玉米酶水解物能值存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，但所有的測值均處于仿生消化系統(tǒng)的測試誤差之內(nèi)。試驗發(fā)現(xiàn)的差異是否具有生物學(xué)意義有待體內(nèi)試驗驗證。仿生消化法可為轉(zhuǎn)基因飼料營養(yǎng)等同性研究提供一種新方法。

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（責(zé)任編輯 武海龍）

Evaluation of Enzymatic Hydrolysate Gross Energy of Glyphosate?Tolerant Corn and Transgenic Bt Corn Using Simulative Digestion System

ZHONG Ruqing CHEN Liang GAO Lixiang HUANG Qinghua LIU Lei ZHANG Hongfu?
（State Key Laboratory of Animal Nutrition，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Abstract:The objective of the present study was to evaluate the energy value of the glyphosate?tolerant corn and transgenic Bt corn or the glyphosate?tolerant corn diet and transgenic Bt corn diet comparing to the isogenic non?transgenic corn or diet using an in vitro digestion method with computer?controlled simulated digestion sys?tem（SDS）.It would provide a reference to develop in vitro method for evaluating the nutritional substantial e?quivalence of genetically modified crops using the SDS.A single factorial completely randomized design with 3 corn ingredients（isogenic non?transgenic corn，glyphosate?tolerant corn，and transgenic Bt corn）and corre?sponding 3 corn diets（isogenic non?transgenic corn diet，glyphosate?tolerant corn diet，and transgenic Bt corn diet）was adapted.The digestion in the stomach and total tract were simulated respectively.The in vitro dry matter digestibility（DMD），in vitro gross energy digestibility（GED），and enzymatic hydrolysate gross ener?gy（EHGE）were determined of corn ingredients and diets.The results showed that the nutrient concentration was similar between the corn ingredients and diets.As a whole，the gastric and total tract DMD，the gastric and total tract GED and the EHGH were not affected by the corn ingredient treatments（P＞0.05）.However，the GED of transgenic Bt corn were lower than the GED of isogenic non?transgenic corn（P＝0.03，coefficient of variation＝0.50%），when the EHGE of transgenic Bt corn diet were greater than the EHGE of isogenic non?transgenic corn diet（P＝0.02，coefficient of variation＝1.12%）.But，above two coefficient of variations were all less than the coefficient of variation of feed ingredients using the SDS（coefficient of variation≤1.64%）.These results suggest that in vitro gastric and total tract digestibility of dry matter and gross energy for glypho?sate?tolerant corn is similar to that for isogenic non?transgenic corn，with transgenic Bt corn has some statistical differences.These differences are all within the test error of the SDS，via next animal testing test and verify.The SDS may supply a new method for evaluating the nutritional substantial equivalence of genetically modified crops.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（5）:1468?1476］

Key words:transgenic maize；in vitro gross energy digestibility；in vitro dry matter digestibility；enzymatic hydrolysate gross energy；simulative digestion system

Corresponding author?，professor，E?mail:zhanghf6565＠vip.sina.com

通信作者:?張宏福，研究員，博士生導(dǎo)師，E?mail:zhanghf6565＠vip.sina.com

作者簡介:鐘儒清（1990—），男，山東棗莊人，碩士研究生，從事飼料營養(yǎng)價值評定研究。E?mail:ruqing＿zhong＠163.com

基金項目:國家轉(zhuǎn)基因重大專項“轉(zhuǎn)基因生物食用飼用安全性評價技術(shù)研究”（2014ZX08011?005）；中國博士后科學(xué)基金資助項目（2014M561113）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP?IAS07）

收稿日期:2014－12－09

doi:10.3969/j.issn.1006?267x.2015.05.017

中圖分類號:S816.17

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1006?267X（2015）05?1468?09