肉雞源多重耐藥空腸、結(jié)腸彎曲菌的耐藥分子特征

胡欣潔，韓新鋒,朱冬梅,賴海梅,羅佩文,曾 杭,周 康,鄒立扣,劉書亮

肉雞源多重耐藥空腸、結(jié)腸彎曲菌的耐藥分子特征

胡欣潔1，2，韓新鋒1,2,朱冬梅1,賴海梅1,羅佩文1,曾 杭1,周 康1,2,鄒立扣3,劉書亮1,2

目的 了解肉雞源空腸和結(jié)腸彎曲菌的耐藥譜特征，檢測多重耐藥菌株Ⅰ類整合子/基因盒、gyrA基因突變位點、tetO基因、23S rRNA突變位點的分子特征。方法 利用PCR檢測彎曲菌Ⅰ類整合子/基因盒的存在情況；利用MAMA PCR技術(shù)檢測彎曲菌gyrA基因第257位堿基的突變情況；針對彎曲菌23S rRNA的V區(qū)2075突變位點檢測突變菌株。結(jié)果 多重耐藥菌株占分離株的94.5%。146株多重耐藥空腸和結(jié)腸彎曲菌中Ⅰ類整合子檢出率為98.6%，有78株菌株檢出3種基因盒，1 000 bp+750 bp+500 bp+250 bp為主要譜型，所占比例為92.3%；有131株在gyrA喹諾酮類耐藥決定區(qū)發(fā)生突變，突變率為92.9%。127株四環(huán)素耐藥彎曲菌tetO基因的檢出率為95.3%。81株紅霉素耐藥菌株中，23S rRNA的V區(qū)2075處突變發(fā)生率為96.3%。結(jié)論 空腸和結(jié)腸彎曲菌分離株攜帶aadA2耐藥基因盒，與氨基糖苷類藥物的耐藥性相關(guān)；gyrA基因突變、tetO基因的攜帶以及23S rRNA突變，與彎曲菌對喹諾酮、四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥密切相關(guān)。

肉雞;空腸彎曲菌;結(jié)腸彎曲菌;耐藥基因;整合子;基因盒

彎曲菌(Campylobacterspp.)，尤其是空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobactercoli，C.coli)是引起彎曲菌病最主要的兩個種，可導致人急性胃腸炎，并有可能進一步引發(fā)格林-巴利綜合征、急性神經(jīng)肌肉癱瘓及反應性關(guān)節(jié)炎等其他疾病。由空腸彎曲菌引起的彎曲菌病占所有病例的80%～90%，由結(jié)腸彎曲菌引起的病例僅占5%～10%。廣泛存在于各種溫血動物的體內(nèi)，以家禽、家畜和野禽中的帶菌量最多，雞是帶菌率最高的動物，構(gòu)成彎曲菌的體外儲存宿主，雞肉中空腸彎曲菌的分離率最高可達100%[1]。人可通過食用受到污染的食品及其制品和水源而患病，其感染率已經(jīng)超過了沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌O157∶H7[2]。

隨著抗菌藥物在動物養(yǎng)殖過程中的大量使用，在藥物的選擇壓力下，彎曲菌能通過細菌之間的基因水平傳播從環(huán)境中獲得耐藥基因，還可通過耐藥質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可動遺傳元件的DNA水平轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生耐藥基因，使得常規(guī)的抗菌藥物和常規(guī)劑量的抗菌藥物使用無效，且其耐藥性可通過食物鏈傳播到人群，加重了臨床治療的難度和疾病負擔。同時，多重耐藥的現(xiàn)象更為彎曲菌感染的治療和疾病的控制提出了考驗。

本研究在對肉雞源空腸彎曲菌分離菌株抗菌藥物耐藥表型的基礎上，應用PCR技術(shù)對多重耐藥菌株進行相關(guān)耐藥基因的檢測，分析各類耐藥基因與彎曲菌耐藥表型之間的關(guān)系，為空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌感染的有效防制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2012-2013年，從四川省某大型肉雞屠宰場的不同環(huán)節(jié)(屠宰前雞糞樣—凈膛環(huán)節(jié)肉雞胴體表面—胴體分割后雞肉表面)采集樣本651份，按照GB/T 4789.9—2008的方法，分離彎曲菌疑似菌株，并以彎曲菌屬的16S rRNA基因、結(jié)腸彎曲菌的ceuE基因和空腸彎曲菌的hipO基因為靶基因，對疑似菌株進行三重PCR鑒定。從樣品中準確鑒定出空腸彎曲菌160株、結(jié)腸彎曲菌130株[3]?？漳c彎曲菌質(zhì)控菌株(ATCC33560)由四川農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 Bolton肉湯、改良Skirrow氏瓊脂基礎、CCDA瓊脂基礎、哥倫比亞血瓊脂基礎、布氏肉湯、M-H培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；新生級小牛血清、脫纖維綿羊血，購自成都康迪生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑 DL1000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、2× long Taq PCR MasterMix購自寶生物有限公司；GoldviewTM核酸染料、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化有限公司。

1.1.4 PCR引物 檢測Ⅰ類整合子/基因盒的2對引物和耐藥基因的4對引物見表1。

表1 檢測空腸彎曲菌Ⅰ類整合子和耐藥基因的PCR引物[4-8]

1.2 方法

1.2.1 抗生素耐藥表型的測定 采用瓊脂稀釋法對空腸和結(jié)腸彎曲菌分離株進行藥物敏感性試驗[9]。受試的8種藥物分別為紅霉素(EM)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、慶大霉素(GEN)、氟苯尼考(FLO)、鏈霉素(STR)、林可霉素(CLI)、四環(huán)素(TET)，均為原粉，購買于浙江新華制藥有限公司。以空腸彎曲菌(ATCC33560)為質(zhì)控菌株，根據(jù)美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)標準[9]和文獻[10-11]進行試驗和結(jié)果判定。耐3種或3種以上藥物的菌株判定為多重耐藥菌株。

1.2.2 PCR模板的制備 采用熱裂解法提取彎曲菌DNA。將在哥倫比亞平板上純化培養(yǎng)后的菌種接種于布氏肉湯中，42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h，12 000 r/min，離心1 min，收集菌體，用滅菌超純水洗滌兩次后，沉淀用80 μL TE(pH8.0)溶解，沸水浴10 min后冰浴5 min，12 000 r/min離心2 min，上清液即為DNA模板[5]。

1.2.3 PCR反應 選取146株多重耐藥彎曲菌菌株，檢測其Ⅰ類整合子攜帶情況，對整合子陽性的菌株擴增其基因盒攜帶情況；選取141株喹諾酮類表型耐藥菌，利用MAMA PCR檢測其gyrA基因第257位堿基的突變情況。針對127株四環(huán)素表型耐藥菌株，檢測其tetO基因攜帶情況；針對81株紅霉素表型耐藥菌株，檢測其23S rRNA基因V區(qū)突變情況。優(yōu)化后的PCR體系為：2×PCR Mix 12.5 μL，模板1.0 μL，10 μmol/L的上下游引物各1.0 μL，補滅菌雙蒸水至最終體積25 μL。MAMA PCR檢測菌株耐喹諾酮類藥物決定區(qū)(QRDR)突變情況時，引物濃度比例為P1∶P2∶P3=5∶4∶1。以上PCR體系擴增條件為：95 ℃預變性10 min；之后95 ℃變性40 s，49～60 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠(1.5%)進行電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

PCR擴增出預期目標條帶的菌株視為Ⅰ類整合子陽性菌株。陽性率=整合子陽性菌株數(shù)/菌株總數(shù)×100%。通過相關(guān)基因盒的擴增，確定整合子陽性菌株所攜帶的基因盒譜，統(tǒng)計不同菌株的PCR產(chǎn)物條帶，得到整合子基因盒的分布情況；并對其大小不一的片段，膠回收并送寶生物(大連)有限公司測序，將測序結(jié)果在GenBank中用 BLAST進行序列搜索和比對分析，獲得整合子編碼的耐藥基因。隨機選取彎曲菌PCR擴增陽性菌株的PCR產(chǎn)物送寶生物(大連)有限公司測序。

2 結(jié) 果

2.1 彎曲菌分離株耐藥譜的測定 290株彎曲菌分離株共產(chǎn)生了52種耐藥譜，耐3種或3種以上藥物的多重耐藥菌株占94.5%(274/290)，對8種藥物都具有耐藥性的占2.1%。耐藥譜CIP LEV GEN TET CLI EM優(yōu)勢明顯，占所有分離株的35.2%；耐藥譜CIP LEV GEN STR TET CLI EM 和CIP LEV TET CLI，均占7.6%；耐藥譜CIP LEV TET占6.9%(表2)。

2.2 Ⅰ類整合子的攜帶情況 選取的146株多重耐藥菌株中，有144株擴增出目的條帶，為Ⅰ類整合子陽性菌株，檢出率為98.6%(144/146)。其中，空腸彎曲菌Ⅰ類整合子陽性率為98.7%(77/78)，結(jié)腸彎曲菌Ⅰ類整合子陽性率為98.5%(67/68)，兩者差異不明顯。

2.2 整合子/基因盒擴增情況 對144株Ⅰ型整合子陽性彎曲菌進行基因盒的擴增，有78株檢測到250～1 000 bp大小的基因盒，基因盒檢出率為54.2%。其中，空腸彎曲菌基因盒檢測率為16.9%(13/77)，結(jié)腸彎曲菌基因盒檢出率為97.0%(65/68)?；蚝薪M合包括3種類型，分別為1 000 bp、1 000 bp+750 bp和1 000 bp+750 bp+500 bp+250 bp，其中1000 bp+750 bp+500 bp+250 bp為主要基因盒組合類型，占92.3%(72/78)，1 000 bp和1 000 bp+750 bp均占3.8%(3/78)。1 000 bp、1 000 bp+750 bp和1000 bp+750 bp+500 bp+250 bp基因盒組合類型均在空腸彎曲菌中檢出，分別占3.9%(3/77)、3.9%(3/77)和9.1%(7/77)，結(jié)腸彎曲菌僅檢出1 000 bp+750 bp+500 bp+250 bp基因盒組合類型，占97.0%(圖1)。測序結(jié)果表明，片段大小為1 000 bp、750 bp左右的整合子序列和GenBank登錄號為AF530636.1和AF530637.1的核酸序列同源性達到99%，為aadA2基因盒，屬氨基糖苷類抗生素的耐藥基因。

M: DL5000 DNA Marker；Lane 1-24: Examples for detection of gene cassettes in relation to classⅠ integron ofCampylobacterspp.

圖1 部分整合子陽性彎曲菌菌株基因盒PCR檢測結(jié)果

Fig.1 Gene cassettes patterns of integronⅠpositiveC.jejuniandC.coliusing PCR

2.3 MAMA PCR檢測彎曲菌分離株gyrA基因點突變結(jié)果 在141株喹諾酮類耐藥菌中，有131株在gyrA基因257位堿基處發(fā)生了突變，突變率為92.9%，空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌gyrA基因257位堿基的突變率分別為97.3%(71/73)、89.7%(61/68)；對喹諾酮類藥物敏感的菌株gyrA基因257位堿基沒有發(fā)生突變(圖2)。

對彎曲菌gyrA基因耐藥決定區(qū)進行序列分析發(fā)現(xiàn)，耐喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)的菌株在第257位堿基發(fā)生了C→T的突變，導致原來的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔欢Z酮類 (環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)敏感菌株在257位均未發(fā)生C→T突變。1株菌株在243位發(fā)生了T→C的突變，4株測序菌株均在360位發(fā)生了T→C的突變，但由于該突變發(fā)生在密碼子的第3位，為同義突變，其編碼的氨基酸沒有發(fā)生改變。

表2 肉雞源彎曲菌耐藥譜的分布情況

M: DL1000 DNA Marker; Lane 1-17: Examples for detection of point mutation in gyrA gene of Campylobacter spp.

2.4 四環(huán)素類耐藥菌株tetO基因檢測結(jié)果 127株四環(huán)素表型耐藥的彎曲菌分離株中，有121株菌株檢測出攜帶有tetO基因，檢出率為95.3%，其中空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的檢出率分別為96.6%(57/59)、94.1%(64/68)。

2.5 大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株23S rRNA基因檢測結(jié)果 81株耐紅霉素的菌株中，有78株菌株在23S rRNA的V區(qū)2 075堿基處發(fā)生突變，突變率為96.3%，其中空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的突變率分別為95.0%(19/20)、96.7(59/61)，紅霉素敏感菌株沒有檢測出該類突變(圖3)。測序結(jié)果顯示，大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)表型耐藥菌株均在第2075位堿基發(fā)生了A→G的突變；而大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素)敏感菌株在2 075位堿基處均未發(fā)生該類突變。

M: DL2000 DNA Marker; Lane 1-24: Examples for detection of mutation in 23S rRNA gene of Campylobacter spp.

3 討 論

通常彎曲菌病導致的腹瀉屬于自限性疾病，但是對于免疫力低下以及癥狀較嚴重的患者，抗生素的使用是有效且必須的。由于空腸彎曲菌分離培養(yǎng)相對困難，加之其藥敏試驗過程復雜，目前國內(nèi)有關(guān)空腸彎曲菌的耐藥數(shù)據(jù)比較缺乏。本研究對肉雞源空腸和結(jié)腸彎曲菌進行了8種抗生素的體外藥敏試驗，為彎曲菌的耐藥性研究提供了一定的基礎數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，肉雞源彎曲菌對喹諾酮類藥物、林可霉素和四環(huán)素的耐藥率較高，原因可能與近年來我國大量使用喹諾酮和四環(huán)素類等抗菌藥物作為飼料添加劑或治療家禽的腹瀉等疾病有關(guān)，與國內(nèi)外有關(guān)報道相近[12-13]。在受試的8種藥物中，94.5%的菌株對3種或3種以上藥物耐受，表明四川地區(qū)雞源彎曲菌的耐藥性已經(jīng)相當普遍和嚴重。

細菌通過整合子系統(tǒng)，不斷從環(huán)境捕獲外來耐藥基因，并進行基因水平轉(zhuǎn)移，使細菌的耐藥性得以廣泛傳播。本試驗的146株多重耐藥菌株中，Ⅰ類整合子檢出率為98.6%，明顯高于Ekkapobyotin(4.82%)[4]、Lee(21%)[14]的報道。推測原因是因為隨著時間的推移和抗生素的大量使用細菌整合子攜帶率逐漸升高。對分離株的耐藥基因盒進行檢測并序列分析，得知所有菌株均含有aadA2耐藥基因盒，是氨基糖苷類抗生素的耐藥基因。

喹諾酮類藥物在食源性動物中的大量使用，導致動物性食品鏈中彎曲菌對喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增強。對喹諾酮類的耐藥機制主要為DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA及拓撲酶Ⅳ的基因突變及細菌溢出泵和外膜孔道蛋白改變造成?？漳c彎曲菌DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA蛋白(Thr-86→Ile)的突變是導致喹諾酮耐藥的主要機制。在該區(qū)域內(nèi)的點突變，能夠?qū)е旅附Y(jié)構(gòu)的改變，阻止藥物進入藥物作用區(qū)，導致細菌耐藥[15-16]。本研究利用MAMA PCR技術(shù)，對耐喹諾酮類彎曲菌gyrA基因257位堿基的突變情況進行了檢測，表明分離株喹諾酮類耐藥決定區(qū)的突變率為92.9%。測序結(jié)果顯示，gyrA基因257位發(fā)生點突變，造成Thr-86→Ile的改變，是導致彎曲菌對喹諾酮類耐藥的主要原因。該基因內(nèi)其余位點的突變，沒有造成氨基酸序列變化，與Said[17]、Sonnevend[18]的結(jié)果一致。本試驗中，有9株對環(huán)丙沙星或左氧氟沙星耐藥的彎曲菌未檢測到gyrA基因257位堿基發(fā)生點突變，原因可能是存在其他關(guān)鍵突變位點或細菌外排泵作用導致彎曲菌耐藥[19]。

tetO基因是一種核糖體保護蛋白，廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，能夠使細菌的核糖體免受四環(huán)素的作用，從而增加細菌的耐藥性。127株四環(huán)素耐藥彎曲菌tetO基因的檢出率為95.3%，其中空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌的檢出率分別為96.6%、94.1%，與Ekkapobyotin[4](97.01%)、Gibreel[7](100.00%)、Qin[14](100.00%)等的結(jié)果相似。本試驗對部分四環(huán)素耐藥菌株未檢測出該基因，可能是由于存在其它耐藥機制，具體原因有待進一步研究。

針對彎曲菌23S rRNA的V區(qū)2075堿基位點進行檢測，81株紅霉素耐藥菌株突變率為96.3%，其中空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌在2075處的突變率分別為95.0%和96.7%，與Qin[14](98.00%)的結(jié)果較為相近。測序結(jié)果顯示，23S rRNA的V區(qū)2075位堿基A→G的突變，是導致彎曲菌對紅霉素耐藥的主要原因，與Payot S[20]的研究結(jié)果相符合。

本文對四川省肉雞源空腸和結(jié)腸彎曲菌進行了耐藥譜特征及耐藥基因檢測的研究，結(jié)果顯示多重耐藥彎曲菌普遍存在，使得感染的危險性和治療困難程度增加。作為一種人獸共患病原菌，彎曲菌的耐藥性應引起足夠重視，加強對其耐藥性監(jiān)控和耐藥機制研究，對于防控多重耐藥菌的傳播和流行具有重要的公共衛(wèi)生意義。

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Molecular characteristics of multidrug resistantCampylobacterjejuniandCampylobactercoliisolated from broilers

HU Xin-jie1,2,HAN Xin-feng1,2,ZHU Dong-mei1,LAI Hai-mei1,LUO Pei-wen1,ZENG Hang1,ZHOU Kang1,2,ZOU Li-kou3,LIU Shu-liang1,2

(1.CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China;2.KeyLaboratoryofAgriculturalProductsProcessingandPreservationEngineeringofSichuanProvince,Ya’an625014,China;3.LaboratoryofMicrobiology,DujiangyanCampusofSichuanAgriculturalUniversity,Dujiangyan611830,China)

Two hundred and ninety broiler originated isolates ofCampylobacterjejuniandCampylobactercoliwere examined for antimicrobial resistance against eight kinds of antimicrobial agents. Results indicated that multidrug resistant (MDR) strains occupied 94.5% of the isolates. A total of 146 isolates of MDRC.jejuniandC.coliwere further researched for classⅠ integron and related cassettes, and the results indicated that 98.6% of the isolates harbored classⅠ integron; 78 isolates were positive for cassettes detection by PCR, 3 kinds of cassettes patterns were included and most (92.3%) of the isolates possessed 1 000 bp+750 bp+500 bp+250 bp cassettes, which was ascribed toaadA2 gene cassettes associated with resistance to aminoglycosides. The 92.9% of the quinolone resistant isolates had the Thr-86-Ile point mutation ingyrAat quinolone resistant determining region (QRDR), 95.3% of the tetracycline resistant isolates carriedtetOgene, 96.3% of the erythromycin resistant isolates were found the A-2075-G mutation in V region of 23S rRNA, respectively. This study provided antimicrobial resistance information for the control and prevention ofC.jejuniandC.coli, and also analyzed the underlying mechanism of resistances to quinolone, tetracycline and erythromycin.

broiler;Campylobacterjejuni;Campylobactercoli; antimicrobial resistance gene; integron; cassette

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.002

國家自然科學基金項目(No.31400066)、 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項子課題(No.200903055)聯(lián)合資助

劉書亮，Email: lsliang999@163.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，雅安 625014; 2.農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，雅安 625014; 3.四川農(nóng)業(yè)大學都江堰校區(qū)微生物學實驗室，都江堰 611830

Supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China (No. 31400066) and the Special Scientific Research Fund of Agricultural Public Welfare Profession of China (No. 200903055) Corresponding author: Liu Shu-liang, Email: lsliang999@163.com

R378

A

1002-2694(2015)08-0694-06

2014-10-18；

2015-01-12