GenoType MTBDRplus快速檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群臨床分離株效果評(píng)價(jià)

魏淑貞，林淑芳，林 建，趙 永，梁慶福，林勇明

GenoType MTBDRplus快速檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群臨床分離株效果評(píng)價(jià)

魏淑貞，林淑芳，林 建，趙 永，梁慶福，林勇明

目的 評(píng)價(jià)GenoType MTBDRplus快速檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(multi-drug resistantMycobacteriumtuberculosis Complex,MDR-MTBC)臨床分離株的應(yīng)用效能。方法 隨機(jī)抽取福建省30個(gè)耐藥監(jiān)測點(diǎn)的129株MTBC包括全敏感菌株50株和79株MDR菌株，應(yīng)用MTBDRplus 檢測，同時(shí)擴(kuò)增MDR菌株的rpoB,katG,inhA基因進(jìn)行測序比對(duì)，并將檢測結(jié)果與比例法藥敏結(jié)果比較分析。結(jié)果 129株MTBC經(jīng)MTBDRplus檢測，Tub條帶均陽性(100%)，50株全敏感株的檢測結(jié)果與比例法藥敏結(jié)果完全一致。79株MDR菌株經(jīng)MTBDRplus檢出67株(84.81%)MDR，10株(12.66%)單耐RFP，2株(2.53%)單耐INH。經(jīng)測序，77株MDR菌株的rpoB基因檢測出突變，71株的katG和/或inhA檢測出突變。以比例法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus檢測RFP、INH耐藥性及MDR的敏感度分別為97.47%(77/79), 87.34%(69/79), 84.81%(67/79)，MTBDRplus檢測RFP、INH耐藥性及MDR的特異度均為100%(50/50),一致率分別為98.45%(127/129),92.25%(119/129)，90.70%(117/129)。結(jié)論 MTBDRplus是一種快速、準(zhǔn)確、操作簡便的技術(shù)，具有很好的應(yīng)用前景，適用于耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的快速檢測，但靈敏度有待進(jìn)一步提高。

結(jié)核分枝桿菌；耐多藥；線性探針；基因突變；快速診斷

耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是全球結(jié)核病控制的重大威脅。我國是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。據(jù)調(diào)查顯示肺結(jié)核病人中耐多藥率為8.32%，其中初治肺結(jié)核耐多藥率為5.7%，估算我國每年大約新發(fā)11萬例MDR-TB患者[2]。MDR-TB的快速診斷有助于減少M(fèi)DR-TB流行傳播。結(jié)核分枝桿菌不同藥物的相關(guān)基因(rpoB,katG,inhA)突變位點(diǎn)與耐藥性有一定相關(guān)性，因此可以通過檢測各突變位點(diǎn)的DNA片段來判斷結(jié)核分枝桿菌耐藥情況。GenoType MTBDRplus(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)試驗(yàn)以探針試條為基礎(chǔ)，基于多重PCR原理，將PCR、反向雜交、顯色合為一體。對(duì)純培養(yǎng)物或抗酸桿菌涂片陽性的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，通過檢測ropB基因突變判定對(duì)RFP的耐藥性，檢測katG基因判定對(duì)INH的高水平耐藥，而檢測inhA基因的啟動(dòng)子區(qū)域判定對(duì)INH的低水平耐藥，因此可以快速檢測MDR-TB。為了評(píng)價(jià)該試劑盒用于福建省臨床分離的耐多藥結(jié)核分枝桿菌的檢測效能，對(duì)129株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)包含79株MDR和50株全敏感菌株進(jìn)行GenoType MTBDRplus檢測。所有MDR菌株經(jīng)rpoB,katG,inhA基因測序，并將檢測結(jié)果與測序結(jié)果比對(duì)分析和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本研究79株MDR和隨機(jī)抽取的50株全敏感株均收集于2010年7月至2011年6月在福建省30個(gè)耐藥監(jiān)測點(diǎn)。分離的菌株均獲得患者知情同意，并且已按照WHO推薦的比例法[1]完成藥物敏感性試驗(yàn)(drug susceptibility test,DST)。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 提取DNA 取常規(guī)L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3周齡、生長良好的結(jié)核菌一菌環(huán)菌落溶于400 μLTE(PH8.0)中，在旋渦振蕩器上震蕩至塊狀固體菌落均勻溶于TE中，在95 ℃水浴15 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清。

1.3 擴(kuò)增rpoB,katG,inhA基因及測序檢測 從http://www.ncbi.nlm.nih.gov的Genebank中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的rpoB,katG,inhA基因序列。采用primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系為50 μL, 包括2ⅹTaq PCR Master Mix 25 μL、引物(10 μM)各2 μL, 模板5 μL，去離子水16 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃變性8 min;94 ℃ 30 s ,退火 30 s (退火溫度依引物而定，如表1)，72 ℃45 s,30個(gè)循環(huán);再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證為單一的擴(kuò)增條帶后，產(chǎn)物送上海生物工程公司測序。測序結(jié)果通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST與H37Rv 的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。同時(shí)排除測序引起的誤差判斷測序結(jié)果。

表1 耐藥基因的擴(kuò)增引物及產(chǎn)物長度

1.4 GenoType MTBDRplus 檢測 根據(jù)GenoType MTBDRplus assay試劑盒說明書進(jìn)行操作。雜交與檢測是采用試劑盒的試劑，在一臺(tái)帶搖晃的半自動(dòng)的TwinCubator(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)上根據(jù)廠家設(shè)定的步驟進(jìn)行操作。先45 ℃雜交30 min,兩次漂洗，然后顯色，再清洗，最后將探針試條吸干粘貼在判讀表上。每個(gè)探針試條共有27個(gè)反應(yīng)條帶:有5個(gè)質(zhì)控帶，CC帶(標(biāo)記物質(zhì)控) 反映探針試條上標(biāo)記物結(jié)合并與定位反應(yīng)的有效性，AC帶( 擴(kuò)增質(zhì)控) 用于確認(rèn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否成功，3個(gè)基因位點(diǎn)質(zhì)控帶(rpoB、katG和inhA)用于確認(rèn)所檢測的相應(yīng)基因位點(diǎn)反應(yīng)的最佳敏感度。Tub帶用于確認(rèn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，當(dāng)Tub帶未出現(xiàn)就不能用本系統(tǒng)判讀結(jié)果。野生型探針的條帶標(biāo)記有WT，突變探針的條帶標(biāo)記有Mut。M 帶是color marker。當(dāng)某一基因區(qū)所有的WT探針染色均為陽性，表示該基因區(qū)沒有發(fā)生可檢測的突變，試驗(yàn)菌株對(duì)相應(yīng)的藥物敏感。如果某1個(gè)基因區(qū)至少有1個(gè)野生型探針WT缺失或突變型探針Mut染色陽性，則表示試驗(yàn)菌株對(duì)相應(yīng)的藥物耐藥。rpoB野生型探針WT1 -WT8是針對(duì)熱點(diǎn)核心區(qū);rpoB突變型探針(Mut1, Mut2A, Mut2B, Mut3)是分別檢測rpoB相應(yīng)的密碼子突變(D516V, H526Y, H526D, S531L)。katG315密碼子野生型探針(WT);katG突變型探針(MUT1,MUT2)分別是檢測AGC-315-ACC(S315T1)和AGC-315-ACA(S315T2)。inhA野生型探針WT1檢測9-22,WT2檢測_1-12;inhA突變型探針Mut1,Mut2,Mut3A,Mut3B分別檢測_15C/T, _16A/G, _8T/C, and _8T/A。探針條帶結(jié)果判讀，如圖1。

注：Neg:陰性對(duì)照，Rv：H37Rv,中間為實(shí)驗(yàn)菌株編號(hào)。

Note: Neg: Negative, Rv: H37Rv, others were tested strains

圖1 結(jié)核分枝桿菌GenoType MTBDRplus檢測結(jié)果

Fig.1 Detection patterns ofMycobacteriumtuberculosisby GenoType MTBDRplus

1.5 質(zhì)量控制 每次GenoType MTBDRplus 檢測均有陽性對(duì)照H37Rv和陰性對(duì)照(水)進(jìn)行質(zhì)控。PCR測序與GenoType MTBDRplus檢測均在雙盲下操作。

1.6 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行整理，通過SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,運(yùn)用χ2檢驗(yàn)比較測序與MTBDRplus檢測結(jié)果之間的差異，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

129株MTBC包括50株全敏感株及79株MDR經(jīng)GenoType MTBDRplus檢測Tub條帶均陽性(100%)。50株全敏感株所有野生型探針均陽性，即MTBDRplus檢測結(jié)果與DST結(jié)果一致。79株MDR經(jīng)MTBDRplus檢測出67株(84.81%)為MDR，10株(12.66%)單耐RFP，2株(2.53%)單耐INH。79株MDR菌株經(jīng)測序，77株菌株的rpoB基因均檢測出突變，71株的katG和/或inhA檢測出突變，有2株經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)katG基因突變位于315之外，故MTBDRplus檢測顯示為INH敏感。

2.1 MTBDRplus檢測RFP耐藥性 79株MDR經(jīng)檢測，rpoB基因區(qū)域出現(xiàn)至少1條野生型探針缺失或出現(xiàn)突變型探針的菌株有77株，占97.47%。有53株出現(xiàn)突變型探針(67.09%)，如表2所示，其中D516V 6株(7.60%)，H526Y 3株(1.27%)，H526D 5株(6.33%)，S531L 38株(48.10%)。有2株(2.53%)判定為RFP敏感，這兩株經(jīng)測序，rpoB基因區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。

2.2 MTBDRplus檢測INH耐藥性 79株MDR經(jīng)檢測，有69株(87.34%)能夠正確判出INH耐藥，如表3所示 ，這69株經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)katG315突變

表2 MTBDRplus檢測79株MDR菌株RFP耐藥性的結(jié)果與測序結(jié)果的比較

注：WT,野生型探針; mut, 突變型探針;r,耐藥;s,敏感; NM, 未突變; del, 缺失;△，缺失.

Note: WT, wild probe; mut, mutated probe; r, resistance;s, sensitive; NM, no mutation; del, deletion;△，dleltion.

表3 MTBDRplus檢測79株MDR菌株INH耐藥性的結(jié)果與測序結(jié)果的比較

注：WT,野生型探針; mut, 突變型探針;r,耐藥;s,敏感; NM, 未突變;△，缺失.

Note: WT, wild probe; mut, mutated probe;r, resistance;s, sensitive; NM, no mutation;△，dleltion.

或inhA基因突變，另有2株測序檢測出katG315密碼子之外的突變而MTBDRplus檢測顯示為陰性。64株katG基因區(qū)域出現(xiàn)315野生型探針缺失或出現(xiàn)突變型探針，即INH高水平耐藥占81.01%,其中58株(占73.42%)S315T1和1株S315T2，這59株突變型探針陽性的菌株經(jīng)測序均檢測出315密碼子氨基酸改變。另測序結(jié)果為S315N的3株菌株和S315T的2株顯示為野生型探針缺失。有9株inhA基因區(qū)域出現(xiàn)野生型探針缺失或出現(xiàn)突變型探針，占11.39%。這9株inhA的突變均為C15T，其中4株在katG基因區(qū)域也出現(xiàn)突變型探針S315T1(AGC315ACC)，與測序結(jié)果完全一致。

2.3 MTBDRplus的檢測效能 若以傳統(tǒng)DST為金標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus檢測RFP耐藥性的敏感度為97.47%(77/79), 檢測INH耐藥性的敏感度為87.34%(69/79), 檢測MDR的敏感度為84.81%(67/79)，MTBDRplus檢測RFP、INH耐藥性及MDR的特異度均為100%(50/50),一致率分別為98.45%(127/129),92.25%(119/129)和90.70%(117/129)。MTBDRplu檢測與測序方法檢測MDR菌株突變特征之間的差異經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=63.93，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

結(jié)果顯示 MTBDRplus能夠用于純培養(yǎng)物MTBC的RFP和INH耐藥性的快速檢測，具有高的敏感度，且操作簡便。MTBDRplus檢測RFP耐藥性的敏感度為97.47%，與國外報(bào)道[3]相一致,高于國內(nèi)報(bào)道的88.48%[4]，這與本文采用結(jié)核分枝桿菌純培養(yǎng)物進(jìn)行檢測有關(guān)。77株(占97.47%)rpoB野生型探針缺失或出現(xiàn)突變型探針，其中出現(xiàn)突變型探針的特征與對(duì)福建省MDR菌株rpoB基因的突變特征報(bào)道相符[5]。且在測序中均被檢測出。測序檢測出的rpoB基因核心區(qū)頻率低突變?nèi)鏛511P,L533P，S531W,H526C,H526L及聯(lián)合突變?nèi)鏓510H+H526R，L511P+D516A，D516G+N518D及del516-517，在MTBDRplus檢測時(shí)顯示為相應(yīng)密碼子野生型缺失。本研究發(fā)現(xiàn)rpoB基因野生型探針WT8缺失的菌株發(fā)生突變?yōu)镾531W或L533P，而關(guān)于rpoB基因533密碼子突變與RFP耐藥性的關(guān)系存在一定爭議，有報(bào)道533密碼子突變與RFP耐藥相關(guān)[6]，也有認(rèn)為533密碼子突變與RPF耐藥無關(guān)[3]，本研究結(jié)果經(jīng)測序核實(shí)，認(rèn)為533密碼子突變與RFP耐藥有一定關(guān)系。另2株MTBDRplus檢測RFP敏感的菌株經(jīng)測序未發(fā)現(xiàn)突變，經(jīng)RFP耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)[7]檢測，也為RFP敏感,這種“假敏感”現(xiàn)象可能由于這兩株菌株rpoB基因突變發(fā)生在核心區(qū)之外，而測序和MTBDRplus及Xpert MTB/RIF只針對(duì)核心區(qū)域，故檢測不出突變；或存在其他的耐藥機(jī)制。

MTBDRplus檢測INH耐藥性的敏感度為87.34%,略高于國內(nèi)報(bào)道的77.78%[5],略低于國外報(bào)道的92.0%[3]。本研究進(jìn)一步表明MTBDRplus用于純培養(yǎng)物的RFP和INH耐藥性檢測的敏感度高于對(duì)涂陽痰標(biāo)本的檢測。經(jīng)MTBDRplus，本研究的79株MDR菌株katG主要以S315T(AGC315ACC )為主，占73.42%。另測序結(jié)果為S315N的3株菌株和S315T的2株顯示為野生型探針缺失。inhA基因突變主要是C15T,未檢出其他位置的突變。有4株在katG基因、inhA基因區(qū)域均出現(xiàn)突變型探針，經(jīng)測序這4株菌株的這兩個(gè)基因均存在突變，進(jìn)一步表明inhA基因突變常伴隨katG基因突變，對(duì)INH耐藥具有協(xié)同作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道相仿[8-10]。MTBDRplus檢測MDR的敏感度為84.81%，主要受限于該方法檢測INH耐藥性的敏感度，若能提高檢測INH耐藥性敏感度，則檢測MDR敏感度也將進(jìn)一步提高。MTBDRplus與測序方法檢測MDR菌株突變特征之間的差異(χ2檢驗(yàn)，P<0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明測序方法檢測MDR菌株的突變能力高于MTBDRplus，同時(shí)有些MDR菌株測序及MTBDRplus檢測結(jié)果均為敏感，主要與測序和MTBDRplus檢測探針只針對(duì)核心區(qū)域或突變率較高的位點(diǎn)有關(guān)。

MTBDRplus檢測耐藥性耗時(shí)比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和DST耗時(shí)大大縮短，僅需5～6 h,可早期發(fā)現(xiàn)患者，能直接用于檢測抗酸涂陽痰標(biāo)本[4,11]，使患者耐藥性檢測成本明顯低于傳統(tǒng)的DST[11]。本研究79株MDR-MTBC和50株全敏感菌株均來自福建省30個(gè)耐藥監(jiān)測點(diǎn)，樣本代表性良好。據(jù)報(bào)道該快速診斷技術(shù)可以用于地市級(jí)MDR-TB檢測[4]，從本結(jié)果來看MTBDRplus檢測技術(shù)非常適合用于MDR-TB快速檢測。因MTBDRplus僅檢測RFP和INH兩種藥物，故不能取代傳統(tǒng)培養(yǎng)和DST。這是因?yàn)樘蹬囵B(yǎng)和一線藥敏極其重要，它是進(jìn)一步做其他藥物藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)；MTBDRplus檢測RFP和INH耐藥性僅針對(duì)于核心突變或突變率高的位點(diǎn)，有些被診斷為敏感的菌株仍然需要做RFP和INH耐藥性核實(shí)確認(rèn)；再者福建省非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的檢出率較高[12]，標(biāo)本可能為NTM或混合性感染。

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Evaluation on the performance of GenoType MTBDRplus assay for rapid diagnosis MDRMycobacteriumtuberculosisisolates in Fujian Province, China

WEI Shu-zhen,LIN Shu-fang,ZHAO Yong,LIN Jin,LIANG Qing-fu,LIN Yong-ming

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

We conducted evaluation on the performance of GenoType MTBDRplus assay for rapid detecting multi-drug resistantMycobacteriumtuberculosisComplex (MDR-MTBC) isolates in Fujian Province, China. The strains including 79 MDR and 50 pan-susceptible were chosen randomly from 30 survey sites. The MTBDRplus was applied to detect RFP and INH resistance of the strains, and the results were compared with the result of sequencing data aboutrpoB,katGandinhAmutation. The Tub control were positive in all strains (100%), the results showed the patterns of 50 pan-susceptible strains were concordant with DST. By the assay, 67 (84.81%) MDR strains of 79 were correctly identified, 10 strains (12.66%) were mono resistant to RFP, and 2 were mono resistant to INH. The mutation inrpoBgene of 77 MDR strains and inkatG/inhAgene of 71 MDR strains was detected by sequencing. Provided that conventional DST is the "gold standard," the sensitivity of the MTBDR assay were 97.47% for RFP resistance detection, 87.34% for INH resistance detection and 84.81% for MDR detection. And the assay had the specificity of 100% for the detection of RFP, INH and MDR. The concordance rate of detection for RFP, INH and MDR was 98.45% (127/129), 92.25% (119/129), 90.70% (117/129), respectively. Thus, the new GenoType MTBDRplus assay represents a rapid, reliable and easy tool for the detection of INH and RFP resistance in clinical strains of MDR in Fujian Province and the sensitivity needs to be improved.

Mycobacteriumtuberculosis; MDR; line probe; gene mutation; rapid diagnosis

梁慶福，Email:liangqingfu@hotmail.com; 林勇明，Email:lym3428425@126.com

福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

Supported by the Fujian Provincial Medical Innovation Project (No. 2014-CXB-8) and the Fujian Provincial Science Foundation Project (No. 2010J01116) Corresponding authors: Liang Qing-fu, Email: liangqingfu@hotmail.com; Lin Yong-ming, Email: lym3428425@126.com

R378

A

1002-2694(2015)08-0728-05

2015-02-09；

2015-05-31

福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(No.2014-CXB-8)和福建省自然科學(xué)基金課題(No.2010J01116)聯(lián)合資助