南京市2007-2013年H3N2流感HA分子進(jìn)化特征分析

杜雪飛，丁 潔，喬夢(mèng)凱，何 敏，石利民，雍 瑋，王 璇

南京市2007-2013年H3N2流感HA分子進(jìn)化特征分析

杜雪飛，丁 潔，喬夢(mèng)凱，何 敏，石利民，雍 瑋，王 璇

目的 分析2007—2013年南京市H3N2亞型流感HA基因分子學(xué)特征。方法 選擇2007—2013年59株H3N2亞型流感分離株，自行設(shè)計(jì)HA片段引物擴(kuò)增分離毒株HA片段并測(cè)序, 利用DNAStar、MEGA等軟件對(duì)HA分子學(xué)特征進(jìn)行分析；結(jié)果 發(fā)病時(shí)間存在明顯的季節(jié)性；進(jìn)化樹(shù)分析2007—2013年分離株按年代分成3個(gè)分支；分離株較疫苗株及不同年份之間，發(fā)生多個(gè)抗原位點(diǎn)及受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸的替換；2007—2013年，我市H3N2亞型流感流行情況出現(xiàn)兩次波動(dòng)，可能同基因的突變、重組有關(guān)。結(jié)論 抗原位點(diǎn)及受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸的突變，對(duì)流感的防控及疫苗的保護(hù)效果產(chǎn)生極大的挑戰(zhàn)。

H3N2；血凝素；進(jìn)化

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，包括A、B、C 3種型別。甲型流感病毒常引起大范圍流感流行，其中H3N2亞型自1968年引起流感大流行以來(lái)一直是人群中流行的主要亞型之一。流感病毒以其表面抗原頻繁變異，每年引起新的流行。H3N2亞型流感病毒的血凝素基因(HA)編碼的血凝素是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原，并在病毒的受體識(shí)別和復(fù)制中起重要作用。研究表明中和抗體所針對(duì)的抗原位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)都位于HA蛋白分子的頭部重鏈區(qū)(HA1區(qū))。HA1區(qū)序列的變異和流感的流行有密切關(guān)系，在流感的抗原性研究和疫苗選擇中有重要意義，研究其分子特征變異在流感的預(yù)防控制工作中十分重要。

1 實(shí)驗(yàn)方法

哨點(diǎn)醫(yī)院收集流感樣病例(ILI)咽拭子， 4 ℃運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，提取病毒RNA后，熒光定量PCR方法進(jìn)行流感病毒型別鑒定。核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本，經(jīng)MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后，吸取上清液置于-80 ℃保存。應(yīng)用Mag MAXTM-96 Viral Isolation Kit提取59株H3N2型流感病毒的RNA，SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。自行設(shè)計(jì)的HA引物PCR擴(kuò)增HA基因片段，然后應(yīng)用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit Protocol對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit熒光標(biāo)記，AB公司3500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

2 統(tǒng)計(jì)分析方法

登陸“中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”，導(dǎo)出南京市2007年1月1日—2013年12月31日流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。利用生物信息學(xué)軟件(DNAStar、Bioedit和MEGA)對(duì)所測(cè)的H3N2流感HA序列進(jìn)行比對(duì)、拼接、構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析比較分離株HA蛋白特征性氨基酸位點(diǎn)的變化情況；通過(guò)BEAST v1.8.0 軟件進(jìn)行BSP(Bayesian skyline plot)模型構(gòu)建。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果 2007—2013年南京市流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室共監(jiān)測(cè)流感樣病例標(biāo)本14162份，監(jiān)測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本665份，平均檢測(cè)陽(yáng)性率4.7%，其中季節(jié)性H3N2亞型356份，季節(jié)性H1N1亞型86份，H1N1(09pdm)亞型30份，B(Yamagata)型45份，B(Victoria)型148份。發(fā)病年齡以15歲以下年齡組居多，占到了42.1%，60歲以上組最少，占7.2%；發(fā)病人群中男、女分別占53.5%、46.5%；每年流感有2個(gè)發(fā)病高峰，第1個(gè)高峰是冬春季，第2個(gè)高峰是夏季。詳見(jiàn)圖1。

圖1 陽(yáng)性病例數(shù)日期分布圖

3.2 進(jìn)化樹(shù) HA進(jìn)化樹(shù)顯示：59株H3N2分離株及2007-2013年WHO推薦疫苗株按年份分成了3個(gè)分支，2007—2008年分離毒株位于Group 3，2007年分離毒株同疫苗株A/Wisconsin/672005 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為：97.8%～99.0%和97.0%～98.1%；2008年分離株同疫苗株A/Brisbane/10/2007 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為98.7%～99.3%和98.7%～99.1%；2009—2010年分離毒株位于Group 2，2009年分離株疫苗株A/Brisbane/10/2007 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為： 98.3%～98.9%和97.4%～98.3%，2010年分離毒株同疫苗株A/Peth/16/2009 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為:99.1%～99.3%和99.1%；2011-2013年分離株位于Group 1,2011分離株同疫苗株A/Peth/16/2009HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為：98.3%和97.8%；2012—2013年分離株同疫苗株A/Victoria/361/2011 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為98.5%～99.3%和97.6%～98.7%，見(jiàn)圖2。

●：疫苗株；分支處的數(shù)字是Bootstrap 檢驗(yàn)的可信度; 標(biāo)尺值0.001 代表單位長(zhǎng)度內(nèi)核苷酸差異水平.

●--Vaccine virus; The numbers in each branch are the credibility of Bootstrap test. Ruler values 0.001 represent the level of number of difference.

圖2 HA基因進(jìn)化樹(shù)示意圖

Fig.2 Phylogenetic tree for the HA gene

3.3 HA1氨基酸位點(diǎn)變化 A/Nanjing/F116/2007等5株2007年分離株同疫苗株A/Wisconsin/67/2005相比，發(fā)生G50E、D122N、S138A、K140I、Q156H、V186G、I223V， A/Nanjing/F31/2007、A/Nanjing/F35/2007同疫苗株相比發(fā)生了D122N、S138A、R142G、N144D、Q156H、K173N、 V186G、I223V；2008年分離株同疫苗株A/Brisbane/10/2007相比發(fā)生K173Q、R269K；2009年毒株同疫苗株A/Brisbane/10/2007相比發(fā)生E62K、N144K、K156N、N189K、V213A；2010年毒株同疫苗株A/Peth/16/2009相比P162S、S214I、I260M、R261Q；A/Nanjing/1481/2011同疫苗株A/Peth/16/2009相比發(fā)生33、45、48等11個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變化；2012—2013年分離株同疫苗株A/Victoria/361/2011相比發(fā)生33、145、156、186、190、219、270等位點(diǎn)氨基酸的變化；2011—2013年毒株同2007—2010年相比，發(fā)生33、45、48、198、212、278、312等位點(diǎn)氨基酸的變化。具體氨基酸位點(diǎn)的變化，詳見(jiàn)表1。

表1 分離株同疫苗株相比氨基酸位點(diǎn)的變化

表1(續(xù))

注：A、B、C、D、E為抗原位點(diǎn)，*為受體結(jié)合位點(diǎn)，黑色標(biāo)記為疫苗株

Note: A, B, C, D, E are Antigenic sites,* represent Receptor-binding sites, Vaccine virus are marked by the black color.

3.4 進(jìn)化動(dòng)力學(xué)分析 BSP(The Bayesian skyline plot)模型可以來(lái)估計(jì)隨著時(shí)間的推移甲型流感病毒流行及病毒基因進(jìn)化動(dòng)力學(xué)的變化[1-2]。本研究通過(guò)BSP建立模型，對(duì)2007—2013年甲型H3N2流感流行及HA基因動(dòng)態(tài)進(jìn)化情況進(jìn)行估算。如圖2所示，H3N2亞型流感有效的種群數(shù)量經(jīng)歷了一段時(shí)間的平穩(wěn)的時(shí)期，從2005年持續(xù)到2008年上半年；緊隨其后的是以一個(gè)顯著上升的速度擴(kuò)散，一直延續(xù)到2009年上半年；然后出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)；在2011年下半年再次出現(xiàn)一個(gè)顯著上升的速度傳播并一直處于較高的水平，延續(xù)到2013年。

4 討 論

圖3 H3N2流感流行動(dòng)態(tài)圖

本研究通過(guò)對(duì)2007—2013年南京市流感樣病例監(jiān)測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，我市流感流行具有明顯的季節(jié)性，每年有兩個(gè)流行高峰，冬春季及夏季，這同我國(guó)北方只存在冬春季一個(gè)流行高峰有一定的差異，同南方省份流感的流行高峰一致[3-4]；眾所周知冬天由于氣候等原因，容易導(dǎo)致流感的流行；夏季可能是人們廣泛使用空調(diào)，室內(nèi)外溫差較大，容易引起流感的發(fā)生。發(fā)病年齡主要分布在15歲以下年齡段，同李偉等的研究結(jié)果一致[5]，符合流感發(fā)病的人群分布[6]。

已有的研究表明，流感病毒HA基因的抗原變異和分子遺傳進(jìn)化最為活躍，且抗原變異主要發(fā)生在HA1區(qū)域[7-8]，該區(qū)域包括抗原位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)、潛在糖基化位點(diǎn)，因此該區(qū)域的氨基酸若發(fā)生變化，可能會(huì)對(duì)病毒的抗原特性、受體結(jié)合特性產(chǎn)生影響。H3N2亞型流感HA1蛋白的329個(gè)氨基酸位點(diǎn)，131個(gè)位于5個(gè)抗原決定簇(A、B、C、D、E)內(nèi)或者附近[9]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株與相對(duì)應(yīng)的疫苗株相比，均發(fā)生多個(gè)抗原位點(diǎn)的變化，其中2011年同疫苗株相比發(fā)生10個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的變化，9個(gè)是抗原位點(diǎn)；不同年份之間同樣存在抗原位點(diǎn)的氨基酸變化，從進(jìn)化樹(shù)不同年份分離株的分支情況也能說(shuō)明這一點(diǎn)。H3N2亞型流感病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)由6個(gè)殘基(98Y、153W、190E、194L、183H、155T)組成口袋的表面，134-138殘基和224-228殘基構(gòu)成了口袋的右壁和左壁。甲型流感病毒血凝素蛋白與唾液酸細(xì)胞受體的結(jié)合在病毒感染過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[10], 且血凝素蛋白的受體結(jié)合特性是流感病毒宿主限制性的重要的決定因素[11-12]。血凝素蛋白結(jié)合的特異性與其受體結(jié)合位點(diǎn)上的一些氨基酸性質(zhì)密切相關(guān), 若這些氨基酸發(fā)生改變，將會(huì)直接影響流感病毒的受體結(jié)合特性，從而逃避宿主攻擊[13]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸變化。以上抗原位點(diǎn)及受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸變化一方面呈現(xiàn)出流感病毒的進(jìn)化速度之快，另一方面這些位點(diǎn)的變化定會(huì)影響病毒的抗原性及受體結(jié)合特性，對(duì)病毒疫苗的保護(hù)效果及流感的防控提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

BSP結(jié)果顯示，自2007—2013年，我市H3N2亞型流感流行情況出現(xiàn)兩次波動(dòng)，可能同基因的突變，重組有關(guān)。2009年出現(xiàn)一個(gè)下降趨勢(shì)，可能與當(dāng)年H1N1(09pdm)亞型流感爆發(fā)流行有關(guān)，此時(shí)H1N1(09pdm)成為優(yōu)勢(shì)毒株。2011年下半年又出現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)。整體呈現(xiàn)2～3年一個(gè)波動(dòng)周期，符合不同亞型流感交叉成為優(yōu)勢(shì)毒株的規(guī)律。原因可能是前一年某亞型流感流行之后，人們體內(nèi)普遍存在該亞型的抗體，再加上疫苗的接種，從而制約了該亞型流感的繼續(xù)流行。但隨著時(shí)間的推移，人們體內(nèi)的抗體減少，流感病毒基因不斷的進(jìn)化，又會(huì)引起新的一輪流行或爆發(fā)。

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Ding Jie, Email: yu2an2002@163.com

Molecular evolution characteristics of HA gene of H3N2 human influenza A viruses between 2007 and 2013 in Nanjing, Jiangsu Province, China

DU Xue-fei,DING Jie,QIAO Meng-kai,HE Min,SHI Li-min,YONG Wei,WANG Xuan

(DepartmentofMicrobiology,NanjingMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210003,China)

We conducted analysis on the molecular characteristics of haemagglutinin of influenza A (H3N2) from 2007 to 2013 in Nanjing. Influenza A virus were isolated and cultured in MDCK cells, and then PCR amplifications and sequencing of the HA genes were carried out. Data were analyzed by DNAStar, MEGA software. Results showed that the incidence of crowd were under 15 years old. The onset time showed obviously seasonal. The phylogenetic tree of isolates strains from 2007 to 2013 could be divided into three branches; there are some antigen sites and receptor binding sites of amino acid substitutions between isolate strains and vaccine strains; the difference also occurred between isolate strains in different years. There are two waves appear of influenza A (H3N2) virus infection during 2007 to 2013 in Nanjing city, maybe result from genetic mutation and recombination. In conclusions, the amino acid mutations of antigen sites and receptor binding sites could make great challenges for influenza prevention and control and the protection effect of vaccine.

H3N2; haemagglutinin; evolution

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.013

丁潔，Email：yu2an2002@163.com

南京市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，南京 210009

Supported by the special Fund for the development of medical technology of Nanjing(No.YKK10129)

R373.1

A

1002-2694(2015)09-0845-05

2015-01-13；

2015-07-17

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金(No.YKK10129)