硫氧還蛋白及其在寄生蟲的研究進展

楊曉宇，王 萌，張德林, 2

硫氧還蛋白及其在寄生蟲的研究進展

楊曉宇1，王 萌1，張德林1, 2

硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)是一類廣泛存在于原核與真核生物體內(nèi)的氧化還原調節(jié)蛋白，與硫氧還蛋白還原酶，NADPH等共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng)，參與調節(jié)機體抗氧化、抗凋亡等生物學過程。由于Trx系統(tǒng)可以清除寄生蟲蟲體自身和宿主免疫細胞產(chǎn)生的的活性氧和活性氮，以減少其對蟲體的損傷，因此寄生蟲Trx的研究日益受到人們的關注?，F(xiàn)對Trx的主要生物學功能及在寄生蟲上的最新研究進展作一綜述。

硫氧還蛋白；生物學功能；寄生蟲

硫氧還蛋白系統(tǒng)是一個NADPH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)，能夠控制細胞氧化還原狀態(tài)和細胞增殖生存，在體內(nèi)廣泛分布[1]。主要包括硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)，硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)，NADPH和硫氧還蛋白過氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TrxP)。其中，硫氧還蛋白(Trx)是一類小分子多功能蛋白質，廣泛存在于原核、真核生物中。它們在進化上相當保守[2]，一般都具有一個相同的二硫化物活性位點序列Cys-Gly-Pro-Cys，由于這一結構特點，還原型Trx可與二硫鍵作用，還原被氧化的蛋白，自身變?yōu)檠趸蚑rx，然后在TrxR及NADPH作用下，再轉變?yōu)檫€原型Trx，繼續(xù)發(fā)揮氧化還原作用[3]。1964年，Trx作為大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)核糖核酸還原酶的電子供體首次被發(fā)現(xiàn)[4]。1967年，有人在大鼠的腫瘤組織中首次發(fā)現(xiàn)哺乳動物Trx，之后一些細胞因子樣分子也被確認為人Trx[5-6]，其中包括妊娠早期因子、成人T細胞白血病衍生因子(adult T cell leukemia-derived factor, ADF)和類白介素-1細胞素等。

Trx廣泛存在于原核和包括人類在內(nèi)的真核生物體內(nèi)。不同類型的Trx在不同生物以及細胞內(nèi)的不同區(qū)域分布不同。根據(jù)一級結構的不同，Trx主要分為Trx1和Trx2兩個家族[7]，Trx1位于胞漿和胞核，含有一個獨特的Trx區(qū)域，絕大多數(shù)生物的Trx屬于Trx1家族；Trx2位于線粒體，含有一個或多個Trx區(qū)域，1991年首次發(fā)現(xiàn)于豬的心臟組織，被認為是Trx家族的一種線粒體特異性蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Trx還與機體內(nèi)核酸代謝、細胞分化增殖及腫瘤發(fā)生等過程相關。因此，Trx及其系統(tǒng)的功能日益受到人們的重視。

1 Trx結構

目前，人們已經(jīng)對多個物種的Trx基因及其表達產(chǎn)物進行了較為詳盡的研究。大多數(shù)物種的Trx氨基酸序列長度在105～110個氨基酸之間，與E.coli的Trx的序列相似性為27%～69%。E.coli的Trx由5個β折疊和4個α螺旋組成，5個β折疊構成一個疏水核心，終末端被4個α螺旋包圍形成球形結構(如圖1)。保守的活性位點序列Cys-Gly-Pro-Cys連接第2個β折疊和第2個α螺旋，是第2個α螺旋的第1個轉折點，這種折疊模式叫做Trx折疊[8]。還原型Trx與蛋白底物X-S2結合后，Cys-32的巰基與X-S2結合形成含有共價鍵的二硫化物，然后去質子的Cys-35作用于此二硫鍵，釋放出被還原的蛋白底物X。Trx高級結構的變化可調節(jié)其功能活性，例如無氧化還原活性的Trx的變異體不能與ASK-l結合，失去了抑凋亡的作用[9]。

注：紅色表示α螺旋；黃色表示β折疊；藍色表示活性位點Cys-Gly-Pro-Cys

Red represents the α-helix; Yellow for β-folded; Blue represents the active site Cys-Gly-Pro-Cys.

圖1 大腸桿菌Trx結構圖

Fig.1 3D model ofE.coilTrx

與E.coli不同，人類和其他哺乳動物的Trx1除了催化位點上的2個半胱氨酸殘基外，其活性位點外側還有3個半胱氨酸殘基(Cys-62, Cys-69和Cys-73)[10-11]，這些結構型殘基構型的改變會影響Trx的生物學活性。Trx2特異地存在于線粒體內(nèi)，在其N-末端有一個60個氨基酸組成的線粒體定位信號肽和一個保守的Trx催化位點Cys-Gly-Pro-Cys[12-13]，其中兩個半胱氨酸殘基在人類Trx2氨基酸序列中分別位于第90、93位。

2 Trx的主要生物學功能

研究表明，Trx抗氧化的主要機制有3個，首先，Trx可以在機體各個氧化還原系統(tǒng)間起到互相耦合和平衡的軸心作用，補充和配合其他氧還系統(tǒng)的功能發(fā)揮。除了Trx系統(tǒng)外，谷胱甘肽(GSH)系統(tǒng)、Prx過氧化物酶(peroxiredoxin)等氧化還原系統(tǒng)在協(xié)同作用下，使細胞內(nèi)的氧還平衡維持在一個相對穩(wěn)定的水平[14]，且Trx系統(tǒng)還能夠幫助GSSG還原成為GSH，維持機體內(nèi)部的GSH濃度[15]。其次，Trx是消除細胞內(nèi)ROS的重要分子。還原型Trx可在TrxP的作用下可直接將ROS清除，如將O-轉化為OH-，從而降低過量的ROS造成的細胞損傷。研究表明，Trx2在犬大腦中高表達，可顯著減輕缺血造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，反之，抑制Trx2基因表達的動物個體會因體內(nèi)ROS過量而死亡[16]。Drechsel 等人對大鼠腦組織線粒體中H2O2進行實時定量測定，發(fā)現(xiàn)當TrxR功能被抑制時，H2O2的消除效率大大降低，說明Trx-TrxR體系對胞內(nèi)ROS的消除起到了重要的作用[17]。另外，Trx還可通過直接作用于氧化應激相關蛋白的二硫鍵，間接抑制氧化應激反應，保護細胞免受氧化劑的損傷[18-20]。

2.2 抗凋亡作用 Trx在調節(jié)細胞凋亡過程中也起著重要作用。ASK-l是一種在誘導細胞凋亡過程中起中樞作用的蛋白酶，它可以通過激活促分裂素原活化蛋白激酶p38(p38MAPKs)、c-Jun氨基末端激酶(c-JNK)和胞外信號調節(jié)激酶(ERK)來誘導細胞凋亡。ASK-l存在于胞漿和線粒體中，可從外源和內(nèi)源兩種途徑誘發(fā)細胞凋亡。Trx是ASK-1的直接抑制劑，可與ASK1的N-端結合，形成Trx/ASK1復合物，使ASK1降解，阻斷ASK1依賴的細胞凋亡。研究證實，Trx1基因或Trx2基因被敲除(沉默)后，啟動ASK-1激活c-JNK依賴的細胞凋亡途徑，發(fā)生不可逆轉的細胞凋亡[21-22]。

除與ASK-1結合，Trx還可以通過以下途徑抑制細胞凋亡：①Trx2可與線粒體基質內(nèi)的細胞色素C (CytC)結合，抑制凋亡信號的傳遞，從而阻止線粒體介導的細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，Trx2缺失體的DT40細胞在培養(yǎng)過程中，細胞內(nèi)的ROS不斷增多，并且CytC從線粒體釋放，激活凋亡誘導因子胱冬肽酶9和胱冬肽酶3，線粒體膜電位下降，導致細胞凋亡?？梢姡琓rx2在清除線粒體內(nèi)的ROS及調節(jié)線粒體細胞凋亡的信號轉導過程中，都起到了重要作用[23]。②Trx還可以通過核因子κB (NF-κB)，調節(jié)神經(jīng)遞質介導的細胞凋亡[24-25]。

2.3 生長因子作用 Trx還是一類生長因子，由淋巴細胞、成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生和分泌，在細胞增殖和生存過程中起著重要的調節(jié)作用。Trx不僅在正常發(fā)育過程中對人多核白細胞、單核細胞等多種細胞的分化起調節(jié)作用，還可以做為生長因子刺激T淋巴細胞增殖[26]。有人發(fā)現(xiàn)當精子處于發(fā)生成熟期時，精子線粒體內(nèi)的Trx持續(xù)增多，而在成熟精子中，Trx則較少。Trx參與構成精子的結構蛋白，有助于精子內(nèi)二硫鍵的形成[27]。

2.4 對蛋白質的修復與還原作用 Trx可以對蛋白質進行修復與活性調控，對機體內(nèi)各種因酶的損傷而受到破壞的體系進行修復。Ritz等用基因敲除的方法驗證硫醇氧化劑(如聯(lián)氨)對E.coli生長的作用，實驗證明，與對照相比，Trx缺失株E.coli遇到硫醇氧化劑時，生長受到明顯抑制[28]。Trx還可以通過改變具有巰基或氨基的酶的構象影響其所在的反應體系。在光合碳循環(huán)中，Rubinsco活化酶、1, 7-二磷酸景天庚酮糖、3-磷酸甘油醛脫氫酶等多個酶都會受到Trx的調控[29]。

3 寄生蟲Trx研究進展

在有氧條件下，機體代謝會產(chǎn)生ROS以及與之類似的一氧化氮(NO)等活性氮族分子(RNS)，二者與細胞內(nèi)氧化還原環(huán)境調控和細胞信號傳導有關。但濃度過高時，會對核酸等生物大分子造成損傷，因此在進化過程中，機體形成了各種抗氧化機制來抵抗RNS和ROS的破壞作用。大部分原生動物寄生蟲是快速復制的需氧生物體，不但要清除內(nèi)生性RNS和ROS，還需要抵抗宿主細胞產(chǎn)生的RNS和ROS，Trx家族就是其主要的抗氧化酶家族之一，因而寄生蟲Trx的作用日益受到人們關注。Trx系統(tǒng)不僅可以清除蟲體自身代謝產(chǎn)生的ROS和RNS，而且在抵抗宿主免疫細胞產(chǎn)生的ROS和RNS的潛在損傷中起著至關重要的作用。

3.1 瘧原蟲Trx 瘧原蟲硫氧還蛋白超家族主要有3種Trx和兩種硫氧還蛋白樣蛋白(thioredoxin like protein, Tlp)。通過保守的活性位點Cys-xx-Cys與蛋白底物的結合，PTrx與PTrxR共同調節(jié)蛋白底物的功能活性。PTrxR只能與三種經(jīng)典的Trx (PTrx1-3)結合，而不能作用于兩種硫氧還蛋白樣蛋白(PTlp1-2)[30]。目前，對于PTrx1的研究最為詳盡，它存在于細胞質中，有一個活性位點WCGPC[31]，可以直接有效地幫助還原GSSG，從而作為GSH系統(tǒng)的備用分子[32]；除了可以清除H2O2等常規(guī)的ROS外，PTrx1還可以直接消除叔丁基過氧化氫(tBuOOH)，枯烯氫過氧化物(CHP)等ROS[33]；PTrx1可以還原S-亞硝基來維持抗壞血酸鹽，硫辛酸，和硫辛酰胺的抗氧化能力；另外，通過巰基/二硫鍵交換，PTrx1還可以特異的作用于S-腺苷甲硫氨酸合成酶和S-腺苷基-L-高半胱氨酸水解酶[34]。PTrx1參與了瘧原蟲蛋白質合成，糖酵解，血紅蛋白分解代謝和信號轉導等一系列生物學過程。因此，Trx系統(tǒng)對于瘧原蟲的存活是不可或缺的。

PTlp1-2是一種與PTrx序列相似性極高的蛋白質，但不能與PTrxR相互作用。研究表明，胞漿PTlp1具有有活性位點WCGPC并積極參與胰島素測定，但不能減少GSSG。 PTlp2是唯一位于線粒體的PTrx，目前其線粒體氧化還原網(wǎng)絡仍有待闡明。

3.2 錐蟲Trx 錐蟲(Trypanosoma)通過吸血昆蟲進行傳播，能夠感染循環(huán)系統(tǒng)、淋巴及其它器官，是一種世界性流行的人畜共患寄生蟲病。錐蟲只有一種Trx，具備Trx的還原二硫鍵、抗氧化的經(jīng)典功能[35-39]。錐蟲Trx等電點(PI=8.5)與其他物種Trx (PI<6)不同，在其第26位氨基酸殘基上的天冬氨酸被色氨酸替換。研究表明，錐蟲TrxR的功能較弱，其主要功能被谷胱甘酰亞精胺還原酶(Trypanothione reductase, TR)所取代。TR屬黃素氧化還原酶類，與硫氧還蛋白家族有遠緣關系，在蟲體內(nèi)定位于線粒體的動基體附近，TR只特異存在于錐蟲體內(nèi)，但不存在于宿主中，其功能還與谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase, GR)相似。可見，由于錐蟲體內(nèi)即不具有其他生物強大的GSH/GR體系，TrxR的功能又較弱，TR對于錐蟲顯得極為重要。

3.3 血吸蟲Trx 血吸蟲(Schistosoma)成蟲主要寄生于人體的腸系膜靜脈中，在不受外界干擾的情況下，血吸蟲可存活30年之久。在發(fā)育過程包括成蟲階段，STrx為高豐度表達蛋白，該蛋白可能是血吸蟲與宿主的相互作用中的關鍵蛋白[40-41]。

2002年，Alger等人從曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)蟲卵分泌物中純化得到硫氧還蛋白(SmTrx)，并證明克隆表達的重組SmTrx能被曼氏血吸蟲感染的鼠血清抗體識別，且制備的抗體能產(chǎn)生循環(huán)免疫沉淀，表明SmTrx具有較好的免疫原性和反應原性，是理想的免疫診斷抗原候選分子。日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)大陸株硫氧還蛋白(SjcTrx)是一種由106個氨基酸組成的小分子球狀蛋白，在蟲體內(nèi)廣泛分布，具有保守的活性位點，是日本血吸蟲生長發(fā)育過程中的一個非常重要的生理分子[42-45]。2006年，韓海渤等人成功構建SjcTrx DNA疫苗及重組抗原蛋白疫苗，建立小鼠免疫/攻擊感染模型，結果發(fā)現(xiàn)小鼠血清中的抗體水平明顯升高，并能誘導強烈的細胞免疫和體液免疫反應，證明SjcTrx的核酸疫苗和重組蛋白疫苗均能對小鼠有一定的免疫保護力，由此認為Trx能夠作為日本血吸蟲疫苗的一個潛在候選因子。2007年，聞禮永將SjcTrx基因克隆至表達載體pPIczaA，并在畢氏酵母菌中成功表達，免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)獲得的SjcTrx重組蛋白具有較好的免疫反應性，且與正常小鼠血清和其他幾種常見寄生蟲感染血清，均無陽性反應條帶[46]，表明SjcTrx重組抗原具有較好的特異性。

4 展 望

Trx是一種在機體內(nèi)廣泛存在的重要的氧化還原平衡調節(jié)蛋白質，具有抗氧化、抗凋亡、調節(jié)細胞生長、分化等重要的生物學功能。在原生動物寄生蟲的生長、繁殖過程中，Trx不僅要清除自身內(nèi)生性 RNS和ROS，還需要抵抗來源于宿主的RNS和ROS對蟲體的破壞，因此，Trx是寄生蟲與宿主相互作用的過程中起關鍵分子之一，尤其對原蟲的存活至關重要，而且，錐蟲Trx系統(tǒng)比GSH系統(tǒng)更為關鍵。但是，目前關于寄生蟲Trx的研究相對較少，不同寄生蟲Trx與宿主細胞相互作用的機制等尚不明確，有待進一步的研究闡明。

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Zhang De-lin, Email: zhangdl2005@163.com

Research progress on thioredoxin and parasitic thioredoxin

YANG Xiao-yu1,WANG Meng1,ZHANG De-lin1, 2

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealthoftheMinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince,LanzhouVeterinaryInstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Lanzhou730046,China; 2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDisease,Yangzhou225009,China)

Thioredoxin (Trx) is a ubiquitous protein regulator of redox reaction in all livings. It operates together with thioredoxin reductase and NADPH as a general protein disulfide catalytic system, playing an important role in several biological processes, such as anti-oxidation and anti-apoptosis. As parasitic Trx system scavenges reactive oxygen species and reactive nitrogen species produced by parasite itself and host immune cells, study on parasitic Trx has been gradually concerned. In this paper, we summarized the newest research progresses on the biological function of thioredoxin as well as parasitic thioredoxin.

thioredoxin; biological function; parasite

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.018

張德林，Email: zhangdl2005@163.com

1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046； 2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009

Funded by the Science Fund for Creative Research Groups of Gansu Province (No. 1210RJIA006)

R38

A

1002-2694(2015)09-0780-06

2015-01-29；

2015-06-04

甘肅省創(chuàng)新研究團體計劃項目(No.1210RJA006)資助