日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的動態(tài)研究

譚建蓉，李文桂，覃 婷

·實(shí)驗(yàn)研究·

日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的動態(tài)研究

譚建蓉1，李文桂2，覃 婷1

目的 動態(tài)觀察日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫BALB/c小鼠后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，探討該疫苗的免疫機(jī)制。方法 將日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗分別經(jīng)口服(PO)和滴鼻(IN)途徑免疫BALB/c小鼠，在免疫后0～20周，每隔2周每組隨機(jī)剖殺4只小鼠，取脾并制備脾細(xì)胞懸液，用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測脾細(xì)胞增殖水平、流式細(xì)胞儀(FACsort)檢測脾CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群和脾細(xì)胞凋亡、雙抗體夾心ELISA法檢測血清及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平和血清抗體IgG及其亞類、IgE和IgA的動態(tài)變化。結(jié)果 當(dāng)SjAWA和ConA刺激或不刺激時(shí)，PO組和IN組脾細(xì)胞增殖水平均于免疫后6周達(dá)最高水平，分別于6周和8周達(dá)最高脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率，脾CD4+T細(xì)胞亞群百分比分別在6周和8周達(dá)峰值，兩組CD8+T細(xì)胞亞群百分比在免疫后2～20周升高不顯著，PO組脾細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平均分別于10周、6周和8周達(dá)峰值，IN組分別在10周、8周和8周達(dá)峰值，口服組血清抗體IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA水平均于8周達(dá)峰值，而IN組除IgG和IgA于8周達(dá)峰值外，其余均于12周達(dá)最高水平，IgE于14周達(dá)峰值，兩組血清細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平分別在免疫后(PO組)14、6和8周及(IN組)8、6和8周達(dá)最高水平。結(jié)論 該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

日本血吸蟲；重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗；免疫

隨著對日本血吸蟲基因組學(xué)研究的不斷深入[1]，選取日本血吸蟲高免疫原性蛋白編碼基因制備各種疫苗，用于防治日本血吸蟲病已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Sj(Schistosomajaponicum)32基因編碼的32 kDa蛋白被證實(shí)為天冬酰胺肽鏈酶[2]，是蟲體消化宿主血紅蛋白的關(guān)鍵酶之一，具有較好的免疫原性。已有研究表明利用該基因制備的血吸蟲疫苗具有較好的免疫保護(hù)性，免疫小鼠后能得到一定的減蟲減卵率[3-4]。為了克服現(xiàn)有日本血吸蟲病疫苗的安全性差、有效性低等缺點(diǎn)，本文在成功構(gòu)建日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗[5]的基礎(chǔ)上，將其免疫小鼠，動態(tài)觀察其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，旨在探索該疫苗的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供有意義的材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 日本血吸蟲成蟲抗原(SjAWA)、日本血吸蟲Bb(pGEX-Sj32)疫苗由本室保存；羊抗小鼠HRP-IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA購自美國Southern Biotech公司；IL-10、IL-12和TNF-α檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自重慶白萃生物；大鼠抗小鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞單抗購自北京邦定泰克；Annexin V-FITC試劑盒(FAK015)購自深圳欣博盛生物科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA)購自美國Sigma；RPMI 1640培養(yǎng)液、10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自上海生工；Elx800UV酶標(biāo)儀(美國Bio-TEK)；流式細(xì)胞儀FACSort(美國Becton Dickinson)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物及免疫方案 88只雌性BALB/c鼠，6～8周齡，體重(18±2) g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。將其隨機(jī)分為兩組：口服免疫組(Per os ,PO)和滴鼻免疫組(intranasal,IN)，PO組：經(jīng)口服單次接種懸浮于100 μL MRS液體培養(yǎng)的重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗1×108克隆形成單位(CFU)；IN組：經(jīng)滴鼻單次接種懸浮于10 μL MRS液體培養(yǎng)的重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗1×105CFU。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束無小鼠死亡。

1.2 方法

1.2.1 脾細(xì)胞分離及血清收集 在疫苗免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周兩組各隨機(jī)剖殺4只小鼠，取眼球血，室溫放置過夜，4 000 r/min離心10 min，收集血清，置-20 ℃保存?zhèn)溆?；無菌取脾，制備成終濃度為5×109/L的脾細(xì)胞懸液，方法同文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 脾細(xì)胞增殖檢測 將分離的脾細(xì)胞(濃度為5×109/L)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每份標(biāo)本設(shè)3組：原液組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、SjAWA刺激組和ConA刺激組，分別加入1mL脾細(xì)胞懸液、1 mL脾細(xì)胞懸液+10 μg 的SjAWA和1 mL脾細(xì)胞懸液+10 μg 的ConA，SjAWA和ConA的終濃度均為10 g/L，最后于每孔加入10 μL的MTT(濃度為5 g/L)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)18 h，棄去細(xì)胞上清液150 μL/孔，加入DMSO 150 μL/孔，吹打至甲臜充分溶解，將混勻的細(xì)胞轉(zhuǎn)至96孔板(150 μL/孔)，同時(shí)設(shè)3個(gè)空白孔為對照，酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度(A)值。

1.2.3 脾細(xì)胞凋亡檢測 將制備的脾細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(細(xì)胞密度為5×109/L)，每份標(biāo)本設(shè)2組：原液組和ConA刺激組，分別加入0.5 mL脾細(xì)胞懸液和0.5 mL脾細(xì)胞懸液加5 μg的ConA，在37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，將培養(yǎng)的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)至1.5 mL無菌Ep管中，4 ℃預(yù)冷的PBS洗兩次，2 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入250 μL結(jié)合緩沖液重調(diào)細(xì)胞密度至1×1010/L，加5 μL的Annexin V-FITC及10 μg/μL的碘化丙錠溶液(PI)10 μL混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀測定脾細(xì)胞的凋亡發(fā)生率。

1.2.4 脾細(xì)胞亞群檢測 將細(xì)胞濃度為5×109/L的脾細(xì)胞懸液與1%的阻斷液各200 μL混勻于1.5 mL EP管，置37 ℃孵育1 h；加1 mL PBS洗滌2次(方法同前)，加入大鼠抗小鼠CD4+或CD8+亞群單抗5 μL，4 ℃放置30 min，加入1 mL PBS洗滌2次，離心并棄上清液，加入5 μL的兔抗大鼠FITC-IgG抗體混勻，4 ℃放置30 min，同上洗滌2次，離心后棄上清液，用FACsort流式細(xì)胞儀測定CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群的百分比。

1.2.5 脾細(xì)胞因子的檢測 將步驟1.2.1制備的脾細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每份標(biāo)本設(shè)原液組(1 mL脾細(xì)胞懸液)、SjAWA刺激組(1 mL脾細(xì)胞懸液+10 μg的SjAWA)和ConA刺激組(1 mL脾細(xì)胞懸液+10 μg的ConA)，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h，收集脾細(xì)胞懸液至1.5 mL EP管，3 000 r/min 離心5 min，收集上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按雙抗體夾心ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-10和IL-12水平。

1.2.6 常規(guī)ELISA法檢測血清抗體IgG及其亞類、IgE和IgA 棋盤滴定法確定最佳抗原包被濃度，每孔加入1 μL的SjAWA(1 μg/μL) 和200 μg抗原包被液包被96孔酶標(biāo)板，置濕盒于4 ℃過夜；棄抗原液，以磷酸緩沖液-吐溫20 (PBST)洗板3次，每次5 min，甩干，每孔加入100 μL封閉液，置濕盒于37 ℃封閉2 h；同上洗板并甩干后，加小鼠血清(15100稀釋)100 μL，置濕盒于37℃反應(yīng)1 h； 同上方法洗板3次，分別加入辣根過氧化物酶HRP (1∶5 000稀釋)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA 100 μL，37 ℃濕浴30 min；同上洗板3次，甩干后，加入100 μL底物液(四甲基聯(lián)苯胺,TMB )，37 ℃反應(yīng)15 min，加入50 μL濃硫酸(2 mol/L)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度(A)值。

1.2.7 雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-10、IL-12和TNF-α水平 分別按IL-10、IL-12和TNF-α試劑盒的說明書操作，檢測細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平；酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度(A)值；通過標(biāo)準(zhǔn)品A值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此計(jì)算各細(xì)胞因子濃度。

2 結(jié) 果

2.1 脾淋巴細(xì)胞增殖 當(dāng)SjAWA和ConA刺激或不刺激時(shí)，PO組小鼠脾細(xì)胞增殖水平均在免疫后2～16周升高，IN組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平均在免疫后2～18周升高，兩組均于免疫后6周達(dá)最高水平，與0周相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)原液組、SjAWA刺激和ConA刺激組比較，SjAWA與ConA能夠明顯促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，ConA作用最強(qiáng)，與原液組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；不同免疫途徑比較，IN組與PO組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見表1)

表1 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞增殖的檢測

Note: Compared with 0 week, *P<0.05, **P<0.01.

2.2 脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率 PO組小鼠在未刺激和ConA刺激時(shí)脾細(xì)胞凋亡率均在免疫后2～14周顯著升高，于6周達(dá)最高水平，在免疫后4～14周兩組細(xì)胞凋亡發(fā)生率與0周相比顯著升高(P<0.01)；IN組小鼠在未刺激和ConA刺激時(shí)脾細(xì)胞凋亡率均在免疫后6～12周升高，于8周達(dá)峰值，與0周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；兩未刺激組脾細(xì)胞凋亡率均明顯低于相應(yīng)的ConA組(P<0.01)；兩免疫途徑比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見表2)

表2 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞凋亡的檢測

Note: Compared with 0 week, *P<0.05, **P<0.01.

2.3 脾細(xì)胞亞群 PO組和IN組小鼠脾CD4+T細(xì)胞亞群百分比均在免疫后2～12周升高，分別在6周和8周達(dá)峰值，與0周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；兩組CD8+T細(xì)胞亞群百分比在免疫后2～20周緩慢升高，僅PO組6～8周、IN組2周和12周與0周相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見圖1)

aP<0.05,bP<0.01,compared with 0 week

圖1 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞亞群的檢測

Fig.1 Splenocyte subsets from mice immunized with recombinant Bb(pGEX-Sj32) vaccine againstSchistosomajaponicum

2.4 脾細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平的檢測 原液、SjAWA和ConA刺激時(shí)，PO組小鼠脾細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平均分別在2～18、2～14及2～14周升高，并分別于免疫后10、6和8周達(dá)最高水平，與0周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；原液、SjAWA和ConA刺激時(shí)，IN組小鼠脾細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平均分別在2～18、2～18及2～14周升高，并分別于免疫后10、8和8周達(dá)最高水平，與0周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。(見表3、表4)

2.5 血清抗體水平 口服免疫組小鼠血清中IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3水平分別在免疫后4～20、2～16、2～20和2～20周升高，并均于8周達(dá)到峰值，且分別在6～16、4～12、6～12和6～10周與0周相比升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，IgG1、IgE和IgA水平僅分別在6～8、12～14和8～10周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余時(shí)間點(diǎn)均未測出；滴鼻組IgG、IgG2a、IgG2b、IgG3水平分別在免疫后2～20、2～20、4～20和2～20周升高，除IgG于8周達(dá)峰值外其余均于12周達(dá)到峰值，且分別在4～14、4～14、10～14和10～12周與0周相比升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，IgG1、IgE和IgA水平僅分別在8～10、14～16和8～10周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余時(shí)間點(diǎn)檢測值為0。(見圖2、圖3)

2.6 血清細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平 與0周相比，口服免疫組IL-10、IL-12和TNF-α水平均于免疫后2～20周升高，并分別在14、6和8周達(dá)最高水平，與0周相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；滴鼻免疫組分別于免疫后2～16、2～20和2～20周升高，并分別在8、6和8周達(dá)最高水平，與0周相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表3 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗口服免疫小鼠脾細(xì)胞上清液IL-10、IL-12和TNF-α水平的檢測

Note: Compared with 0 week,*P<0.05，**P<0.01.

表4 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗滴鼻免疫小鼠脾細(xì)胞上清液IL-10、IL-12和TNF-α水平的檢測

Note: Compared with 0 week, *P<0.05, **P<0.01.

圖2 rBb(pGEX-Sj32)疫苗口服免疫小鼠血清抗體的動態(tài)變化

Fig.2 Dynamic changes on the levels of antibodies in sera of BALB/c mice orally immunized with rBb (pGEX-Sj32) vaccine

圖3 rBb(pGEX-Sj32)疫苗滴鼻免疫小鼠血清抗體的動態(tài)變化

Fig.3 Dynamic changes on the levels of antibodies in sera of BALB/c mice intranasally immunized with rBb(pGEX-Sj32) vaccine

表5 rBb(pGEX-Sj32)疫苗免疫小鼠血清細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的動態(tài)變化

Note: Compared with 0 week, *P<0.05, **P<0.01.

3 討 論

大量研究表明日本血吸蟲疫苗經(jīng)滴鼻和口服免疫小鼠后，在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)32 kDa抗原蛋白，該抗原經(jīng)免疫提呈細(xì)胞有效提呈，與MHC-II類分子結(jié)合成免疫復(fù)合物，被體內(nèi)T淋巴細(xì)胞所識別，使其不斷增殖分化為CD4+T淋巴細(xì)胞，而經(jīng)分化成熟的CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步活化為輔助性T(Th)細(xì)胞，受抗原性質(zhì)和局部免疫微環(huán)境等因素的影響，Th(Th1/Th2)細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子引起和(或)加強(qiáng)體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究表明Th1型細(xì)胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ具有活化T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-10可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，兩種機(jī)制共同作用加強(qiáng)免疫[7-9]。

機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答是體內(nèi)各免疫細(xì)胞、特異性抗體及多種細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中細(xì)胞間相互作用、免疫細(xì)胞的生長和分化等，是一類重要的免疫活性分子。研究表明Th1型細(xì)胞因子IL-12和TNF-α具有重要的免疫學(xué)效應(yīng)，IL-12可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1方向分化成熟，分泌細(xì)胞因子TNF-α和促進(jìn)抗體IgG2a產(chǎn)生、抑制IgG1生成而形成Th1型免疫保護(hù)作用[10]，Cheng等[11]研究發(fā)現(xiàn)IL-12能阻礙血吸蟲雌蟲生長，減少產(chǎn)卵，從而減輕由蟲卵引起的病理性炎癥反應(yīng)和纖維化，以上研究表明IL-12是一類重要的免疫增強(qiáng)和保護(hù)因子。細(xì)胞因子TNF-α在血吸蟲感染免疫中可通過募集多種粒細(xì)胞而引發(fā)炎癥反應(yīng)，能介導(dǎo)蟲卵肉芽腫形成及殺傷童蟲，大量研究表明多種血吸蟲疫苗的免疫保護(hù)力都與其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平TNF-α有關(guān)[12-14]。而抗體具有凝集抗原、降低毒素水平、發(fā)揮體液免疫和輔助細(xì)胞免疫等重要作用，自然感染日本血吸蟲后體內(nèi)產(chǎn)生的IgG抗體及其亞類起到主要的抗炎殺蟲作用，其機(jī)制與其增強(qiáng)NK及巨噬細(xì)胞吞噬能力、中和毒素、細(xì)胞毒效應(yīng)和激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑等作用相關(guān)[15]。Tu等[16]研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲pIRES-SjFABP-Sj26GST疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平IgG抗體，從而引發(fā)特異性體液免疫應(yīng)答；Dai等[17]將日本血吸蟲rAdV-SjTPI.opt疫苗分別經(jīng)皮下及肌內(nèi)注射免疫小鼠后檢測到高水平IgG、IgG1和IgG2a抗體及多種Th1和Th2類細(xì)胞因子，認(rèn)為該疫苗的保護(hù)作用與抗體介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)和細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)；Wang等[18]對PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23-mHSP70疫苗研究發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IgG2a、IL-2和TNF而介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答發(fā)揮保護(hù)作用。本研究顯示日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞早期即開始大量增殖，并向CD4+T淋巴細(xì)胞亞群優(yōu)勢分化，進(jìn)而在免疫早中期分泌IL-12和TNF-α等Th1類細(xì)胞因子，在免疫后期則以分泌IL-10等Th2類細(xì)胞因子為主，共同發(fā)揮有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答；與此同時(shí)，某些細(xì)胞因子還可促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，加強(qiáng)抗體IgG及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3產(chǎn)生，引發(fā)體液免疫應(yīng)答，在抗日本血吸蟲感染中發(fā)揮重要的作用。推測日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj32)疫苗表達(dá)的抗原分子主要與MHC-II類分子結(jié)合促進(jìn)CD4+T細(xì)胞亞群升高，增殖活化為Th細(xì)胞分泌IL-12、IL-10和TNF-α等多種細(xì)胞因子,發(fā)揮免疫效應(yīng)；并通過正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，CD4+T細(xì)胞不斷增殖，使免疫效應(yīng)得以強(qiáng)化并維持；同時(shí)某些細(xì)胞因子抑制CD8+T細(xì)胞亞群的分化，TS細(xì)胞相應(yīng)減少，阻礙了其免疫下調(diào)作用，如此形成CD4+T細(xì)胞亞群分化優(yōu)勢；分化成熟的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生大量的Th1和Th2類細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過募集炎癥細(xì)胞聚集、介導(dǎo)吞噬細(xì)胞吞噬等作用發(fā)揮強(qiáng)效的細(xì)胞免疫，同時(shí)以不同的方式(促進(jìn)、抑制和類別轉(zhuǎn)換)參與抗體的成熟和產(chǎn)生，從而發(fā)揮中和毒素、促進(jìn)補(bǔ)體產(chǎn)生及連接殺傷細(xì)胞等體液免疫，如此建立細(xì)胞因子之間、細(xì)胞因子與抗體和免疫細(xì)胞之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)模式，形成該重組疫苗誘導(dǎo)的強(qiáng)效免疫保護(hù)機(jī)制。

研究表明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是血吸蟲產(chǎn)生病理損傷及免疫逃避的關(guān)鍵[19]。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲可分泌抗原物質(zhì)上調(diào)T淋巴細(xì)胞表面FasL的表達(dá)，促進(jìn)皮膚T淋巴細(xì)胞的凋亡，逃避機(jī)體對其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，阻斷和(或)干預(yù)免疫細(xì)胞凋亡有助于控制各炎癥反應(yīng)和病理損傷。本研究顯示兩組小鼠脾細(xì)胞凋亡率在免疫后早中期顯著升高，分別在6周(PO組)和8周(IN組)達(dá)峰值，免疫后期細(xì)胞凋亡發(fā)生率則逐漸下降，可見rBb(pGEX-Sj32)疫苗對脾淋巴細(xì)胞凋亡具有抑制效應(yīng)。推測早中期凋亡現(xiàn)象與疫苗誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞大量增殖有關(guān)，為了提升自身免疫能力機(jī)體需要不斷更新免疫細(xì)胞而啟動反饋性凋亡反應(yīng)，促進(jìn)老的、免疫效力低下的淋巴細(xì)胞凋亡；另一方面機(jī)體需要維持穩(wěn)定而高效的免疫力，增殖的效應(yīng)性T細(xì)胞分泌凋亡抑制因子，抑制脾淋巴細(xì)胞凋亡。通過以上機(jī)制，疫苗的總效應(yīng)表現(xiàn)為抑制脾淋巴細(xì)胞凋亡，使機(jī)體儲備較多的免疫活性細(xì)胞，從而上調(diào)免疫應(yīng)答。

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Li Wen-gui, Email: cqliwengui@163.com

Dynamic study on immune responses of BALB/c mice induced by the recombinant Bb (pGEX-Sj32) vaccine againstSchistosomajaponicum

TAN Jian-rong1,LI Wen-gui2,QIN Ting1

(1.DigestivesystemdepartmentBofXiangyanghospitalaffiliatedtoHubeiuniversitymedicine,Xiangyang,441000; 2.InstituteofInfectiousandParasiticDisease,theFirstAffi1iatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

To observe the dynamic changes of immune responses in mice immunized with recombinant vaccineBifidobacteriumbifidum(pGEX-Sj32) ofSchistosomajaponicumand study the immune mechanisms of the recombinant vaccine, each mouse in this study was immunized with recombinant Bb (pGEX-Sj32) vaccine by per os (PO group) and intranasally (IN group) with recombinant vaccine. During week 0-20 after immunization, splenocytes and eye blood sera of 4 mice from each group were separated at 2-week interval. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to detect the levels of antibodies IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgE, IgA and cytokine interleukin(IL)-10, IL-12 and tumor necrosis factor(TNF)-a. Splenocyte proliferation was investigated by MTT colorimetric assay, subsets of CD4+and CD8+T cells and apoptosis of splenocytes by FACsort flow cytometry, respectively. The maximum proliferation efficiencies of both PO and IN group got on week 6 after immunization, while the apoptotic rates appears on 6thweek without any stimulation as well as on 8thweek with ConA. Rates of CD4+T and CD8+T cells subsets reached to the peak on 6thand 8thweek in PO group after immunization while on 8thand 12thweek in IN group, respectively. The level of TNF-α, IL-10 and IL-12 in splenocyte supernatant peaked on the 8th, 10thand 6thweek in group PO, while got the maximum on the 8th, 10thand 8thweek in group IN, respectively. Except for IgE reached peak on the 14th week, all mice developed significant peaks of specific IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 and IgA on the 8th week in PO group and those appeared on the 12thweek (IgG and IgA peaked on week 8) in group IN, respectively, compared to 0 week (P<0.05 orP<0.01). The level of IL-10, IL-12 and TNF-αwhich detected in serum peaked on the 14th, 6thand 8thweek respectively in group PO, and got the maximum on the 8th, 6thand 8thweek in group IN, respectively. The rBb (pGEX-Sj32) vaccine may induce mice to produce immune response effectively.

Schistosomajaponicum; rBb (pGEX-Sj32) vaccine; immune

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.005

重慶市科委地方病重大專項(xiàng)基金資助(2008AB5055；2008AB5008；2008AB5054)

李文桂，Email：cqliwengui@163.com

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院消化內(nèi)科B病區(qū)，襄陽 441000; 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

Supported by the Major Special Found of Endemic Disease of Chongqing (Nos. 2008AB5005, 2008AB5008 and 2008AB5054)

R383.2

A

1002-2694(2015)09-0805-07

2014-11-11；

2015-02-02