紅棗中總黃酮類化合物的提取及其抗氧化性能的研究

陳宗保，王國(guó)穩(wěn)

(1.上饒師范學(xué)院 江西省高等學(xué)校應(yīng)用有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 上饒 334001;2.婺源縣清華中學(xué)，江西 婺源 333200)

由于紅棗中含有營(yíng)養(yǎng)豐富，它具有多種營(yíng)養(yǎng)保健功能，而且具有肉厚、色紅、飽滿、核小、味甜等特點(diǎn)。因此，在我國(guó)各地均有種植紅棗。同樣，紅棗中還含有紅棗多糖化合物、黃酮類化合物、三萜類化合物、腺苷、生物堿和甾醇等生物活性成分，這些化合物具有很強(qiáng)生理活性，能合理地調(diào)節(jié)生理功能［1］。據(jù)報(bào)道，食物中提取的黃酮類化合物能夠達(dá)到預(yù)防冠狀動(dòng)脈及腦血管疾病的效果，有效地改善心腦血管中血液循環(huán)，降低中老年人血糖，提高人體抗氧化性及抗癌性等作用［2－3］。當(dāng)前，各類食品中總黃酮化合物的提取方法一般包括振蕩提取法、有機(jī)溶劑浸潤(rùn)提取法、超聲波輔助提取法［4］。將提取的黃酮化合物經(jīng)有效處理，研究其體外抗氧化性及清除自由基能力報(bào)道較多［5－8］。

本文采用有機(jī)溶劑乙醇為提取劑，結(jié)合超聲波輔助技術(shù)對(duì)紅棗中總黃酮化合物進(jìn)行提取，優(yōu)化了各種提取條件。然后，將提取的總黃酮化合物進(jìn)行體外清除羥基自由基與超氧陰離子自由基能力的研究，并與L－抗壞血酸抗氧化性能進(jìn)行比較，從而可知，紅棗的抗氧化性能力，為判斷紅棗的品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗(市售);蘆丁，L－抗壞血酸(Vc)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海);鄰二氮菲、鄰苯三酚、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉及無(wú)水乙醇、AlCl3、KAc:均為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?二次蒸餾水。超聲波提取儀HK－100B:杭州匯爾儀器公司;UV紫外－可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器公司;TG328A電光分析天平:上海第二天平儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理:紅棗洗凈去核，切片，粉碎后，備用。稱取棗粉20.0g兩份，分別加入100mL 60%的乙醇，在超聲功率為90W、溫度為50℃下提取50min;抽濾2次，取濾液，再加入0.5g活性炭，抽濾，取濾液，最后減壓蒸餾、濃縮。樹脂純化:把紅棗黃酮濃縮液用D101樹脂純化。收集純化提取液，再減壓濃縮、真空干燥乙醇定容到50mL。

1.2.2 提取總黃酮含量的測(cè)定

1.2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)確定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品2.5mg于25mL容量瓶中，加入30%乙醇稀釋至刻度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10mg/mL)。準(zhǔn)確移取1.0mL于10mL容量瓶，分別加入0.1mol/L AlCl3溶液2mL，1.0mol/L KAc溶液3mL，振蕩搖均，靜置6min后，并加入30%乙醇至刻度，搖均后在420～540nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，測(cè)得其最大吸收波長(zhǎng)為510nm。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別移取標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于 10mL 的容量瓶中，分別加入 0.1mol/L AlCl3溶液2mL，1.0mol/L KAc溶液3mL，振蕩搖均，靜置6min后，以30%乙醇稀釋至刻度，搖均。在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得回歸方程為 Y=0.1020x+0.0468，R=0.993。

1.2.2.3 樣品測(cè)定

稱取20.0g紅棗粉于250mL燒杯中，按實(shí)驗(yàn)方法1.2.1處理后，并對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為12.43mg/g(n=5)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%。

1.2.3 受試物溶液的配置

分別以無(wú)水乙醇溶配制六個(gè)不同濃度的提取物。六個(gè)10mL棕色容量瓶中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL提取的總黃酮類化合物，再用二次蒸餾水定容致10mL，混合均勻，備用。然后，準(zhǔn)確稱取樣品Vc25mg用無(wú)水乙醇溶解定容至25mL，適當(dāng)稀釋至所需濃度。

1.2.4 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 清除羥基自由基能力

在清除羥基自由基能力的實(shí)驗(yàn)中，我們采用Fenton反應(yīng)。其流程如下:在10mL棕色瓶中，分別加入用無(wú)水乙醇配制的 1.0mL 5mmol·L－1鄰二氮菲溶液，0.5mL 磷酸緩沖溶液(pH7.4)，0.2mL 0.1% 的 H2O2溶液和1.0mL 5mmol·L－1的FeSO4，然后，加入2.0mL配制好的不同濃度的提取物，37℃下加熱30min后，測(cè)定在510nm處的吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定無(wú)提取物的吸光度A。得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果按下列式子計(jì)算提取物的羥基自由基清除能力(Scavenging activity，SA(%))。

1.2.4.2 清除超氧陰離子自由基能力

在清除超氧陰離子自由基能力的實(shí)驗(yàn)中，我們利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)。首先，在不同比色管中分別加入5.0mL Tris－HCl緩沖溶液中(pH8.2)和2.0mL 不同濃度提取物。然后，加入用0.01mmol·L－1HCl配制的0.5mL鄰苯三酚(5.0mmol·L－1)溶液，充分混合。選定320nm為測(cè)定波長(zhǎng)，每間隔30s，連續(xù)測(cè)定20次，通過(guò)吸光度隨時(shí)間變化，計(jì)算的速率k1。同樣，計(jì)算無(wú)提取物的速率k0，結(jié)果按下式計(jì)算提取物清除超氧陰離子自由基的能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇:

準(zhǔn)確稱取各20.0g紅棗粉末，采用超聲波輔助提取方法，并優(yōu)化超聲波提取方法的各種影響因素(提取時(shí)間、溫度、溶劑)。在超聲波輔助提取法下，選用無(wú)水乙醇、60%乙醇，熱水三種溶劑對(duì)紅棗粉末進(jìn)行有效提取。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，采用60%乙醇提取的總黃酮量效果最高，其測(cè)定總黃酮化合物的含量為12.43mg/g，而無(wú)水乙醇與熱水溶劑提取的總黃酮類化合物僅分別為9.78mg/g和5.26mg/g。因此，實(shí)驗(yàn)選擇60%乙醇為超聲波輔助提取方法的提取溶劑。

2.1.2 提取溫度的選擇

實(shí)驗(yàn)以60%乙醇為提取劑的條件，考察了在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五種不同溫度的提取效率，結(jié)果如圖1所示:當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，提取效率達(dá)到最大，溫度再升高基本保持不變。

圖1 溫度對(duì)總黃酮化合物的影響

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

在以60%乙醇為提取劑與提取溫度為60℃的實(shí)驗(yàn)條件，考察了提取時(shí)間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到50min，總黃酮化合物的含量基本沒(méi)有變化，實(shí)驗(yàn)選擇了提取時(shí)間為50min。

2.2 清除自由基的能力

2.2.1 清除羥基自由基能力

按照實(shí)驗(yàn)1.2.4.1方法進(jìn)行清除羥基自由基的能力試驗(yàn)，從圖2中可以看出，隨著提取物濃度的增大，總黃酮提取物溶液對(duì)清除羥基自由基的能力在不斷加強(qiáng)，與相同濃度Vc清除羥基自由基能力相比較，其清除能力略低。然而，紅棗總黃酮提取物具有一定的抗清除羥基自由基能力。

圖2 總黃酮提取物與Vc的清除羥基自由基能力

2.2.2 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力

按照實(shí)驗(yàn)1.2.4.2方法比較了紅棗提取的總黃酮類化合物與Vc對(duì)超氧陰離子自由基清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，隨著紅棗總黃酮提取物的濃度的不斷增加，總黃酮提取物溶液對(duì)超氧陰離子自由基清除能力也在不斷提高。清除超氧陰離子自由基清除能力與相同濃度的Vc比較，其清除能力有一定的下降。

圖3 總黃酮提取物與Vc的清除超氧陰離子自由基能力

3 結(jié)論

利用超聲波輔助提取法提取紅棗中總黃酮類化合物，并優(yōu)化提取條件，在最佳的提取條件下得到的總黃酮類化合物進(jìn)行體外清除羥基自由基與超氧陰離子自由基能力，并與Vc的抗氧化性能比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅棗總黃酮提取物具有一定的抗氧化能力，具有良好開發(fā)價(jià)值。

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