肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌耐藥基因檢測與耐藥相關(guān)性分析

賴海梅,鄒立扣,劉書亮,2,*,韓新鋒,2,周 康,2,羅佩文,夏小龍,李建龍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實驗室,四川雅安 625014;3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實驗室,四川都江堰 611830)

肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌耐藥基因檢測與耐藥相關(guān)性分析

賴海梅1,鄒立扣3,劉書亮1,2,*,韓新鋒1,2,周 康1,2,羅佩文1,夏小龍1,李建龍1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實驗室,四川雅安 625014;3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實驗室,四川都江堰 611830)

目的:了解肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌耐藥性與耐藥基因的相關(guān)性。方法:采用紙片擴(kuò)散法對肉雞屠宰生產(chǎn)鏈分離鑒定的72株沙門氏菌進(jìn)行10種抗生素敏感性實驗;采用PCR方法檢測耐藥沙門氏菌相應(yīng)的耐藥基因。結(jié)果:72株肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對萘啶酸(100%)的耐藥率最高;對氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、慶大霉素耐藥率分別為69.44%、54.17%、38.89%、34.72%、13.89%。72株沙門氏菌中有67株至少含有一種耐藥基因,blaTEM、blaCMY-2、sul2、sul3、tetB和tetC耐藥基因較為普遍,其耐藥菌blaTEM、blaCMY-2、sul2、sul3、tetB和tetC基因檢出率分別為96.08%、100%、94.87%、71.79%、78.38%和100%。結(jié)論:沙門氏菌對常見抗生素具有不同程度的耐藥性,且耐藥基因普遍存在于耐藥菌株中,藥敏實驗結(jié)果與耐藥基因檢測結(jié)果有很高的一致性(≥75%)。

肉雞屠宰生產(chǎn)鏈，沙門氏菌，敏感性實驗，耐藥基因

表1 PCR擴(kuò)增引物

沙門氏菌是腸桿菌科中最重要的病原菌之一,該菌呈全球性分布,絕大多數(shù)沙門氏菌可通過食品污染危害人類健康。隨著抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用,沙門氏菌對常見抗生素和常規(guī)劑量的抗生素產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性,給獸醫(yī)臨床診斷和治療帶來了極大危害。許多編碼耐藥性的基因可在動物和人類病原菌間水平傳播,危害養(yǎng)殖業(yè)和人類健康[1-2]。目前,各類抗生素耐藥機(jī)制較為復(fù)雜且已知的耐藥基因都有幾種至幾十種[3-4]。國內(nèi)外對畜禽沙門氏菌耐藥性及耐藥基因研究報道逐漸增多,但對肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌耐藥基因的檢測情況不多,且沙門氏菌耐藥基因檢出情況在不同年份和不同地區(qū)均存在一定差異[5-10]。本實驗對肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌進(jìn)行了耐藥性分析,并設(shè)計了11對耐藥基因引物,檢測沙門氏菌耐藥基因攜帶情況,為研究肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌耐藥性與耐藥基因的關(guān)系提供參考,也為控制肉雞屠宰生產(chǎn)鏈沙門氏菌的耐藥性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌 均分離于某肉雞屠宰場(糞樣31株,屠宰場生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面12株,分割雞肉產(chǎn)品29株);質(zhì)控菌株:大腸桿菌ATCC25922和大腸桿菌ATCC35218 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實驗室保存;DNA Marker DL2000、瓊脂糖、2×PCR mix等 購于寶生物(大連)有限公司;培養(yǎng)基M-H瓊脂、M-H肉湯 購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;青霉素類:氨芐西林(AMP,10μg/片)、阿莫西林/克拉維酸(AMC,20/10μg/片);頭孢類:頭孢曲松(CRO,30μg/片),氨基糖苷類:慶大霉素(CN,10μg/片)、大觀霉素(SH,100μg/片),四環(huán)素類:四環(huán)素(TET,30μg/片),氯霉素類:氟苯尼考(FLO,75μg/片),磺胺類:甲氧芐啶/磺胺甲噁唑(SXT,1.25/23.75μg/片),喹諾酮類:萘啶酸(NAL,30μg/片)、環(huán)丙沙星(CIP,5μg/片) 均購自賽默飛世爾生物化學(xué)(北京)有限公司。

DHP-9162 恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SORVALL 離心機(jī) 美國科俊儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) Millipore公司;C1000 Thermal Cycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng) Bio-RAD。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥敏實驗 以大腸桿菌ATCC25922和大腸桿菌ATCC35218為質(zhì)控菌株,采用紙片擴(kuò)散法測定72株沙門氏菌對以上10種抗菌藥敏感性實驗。具體方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI 2010)手冊的紙片擴(kuò)散法[11]。耐藥率計算:耐藥率(%)=(耐藥菌株數(shù)/菌株總數(shù))×100。

1.2.2 沙門氏菌耐藥基因的PCR檢測 根據(jù)藥敏實驗結(jié)果判斷耐藥表型,以耐藥菌作為實驗菌株。

菌株CEH-ST79的發(fā)酵液對馬鈴薯干腐病的活體試驗結(jié)果顯示(表3)，菌株CEH-ST79發(fā)酵液可明顯抑制馬鈴薯干腐病病原菌。其中，發(fā)酵液對病原菌65B-2-6具有高抑制活性，抑制率為73.83%，病斑深度為0.51 cm，壞果率為37%；對病原菌青9A-5-2具有中等的抑制活性，抑制率為50.19%，病斑深度為1.22 cm，壞果率為56%；對病原菌青9A-4-13具有弱的抑制活性，抑制率為28.13%，病斑深度為1.67 cm，壞果率為100%。

1.2.2.1 模板的制備 采用熱裂解法[12-13]提取沙門氏菌DNA,取1.5mL培養(yǎng)18～24h的沙門氏菌培養(yǎng)液,12000r/min離心2min,沉淀用1mL滅菌超純水反復(fù)洗兩次,12000r/min離心2min,沉淀加100μL 1×TE(pH8.0)溶液重懸細(xì)胞,100℃水浴10min,再置于冰水浴5min,12000r/min離心2min,上清液即為PCR模板,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR反應(yīng) 根據(jù)Genbank和文獻(xiàn)[14-19]設(shè)計11對引物(表1),分別擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類耐藥基因、氨基糖苷類耐藥基因、四環(huán)素耐藥基因、氟苯尼考耐藥基因和磺胺類耐藥基因。PCR擴(kuò)增條件:94℃ 10min;94℃ 40s,55～72℃ 1min,72℃ 40s,30個循環(huán);72℃ 10min。4℃保存。隨機(jī)選取沙門氏菌菌株P(guān)CR產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司克隆測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌耐藥性

采用紙片擴(kuò)散法檢測72株沙門氏菌對10種抗生素的敏感性。結(jié)果表明,沙門氏菌對萘啶酸的耐藥率最高,耐藥率達(dá)100%;對氨芐西林、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、環(huán)丙沙星耐藥率較高,分別為69.44%、54.17%、51.39%、38.89%;對慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、氟苯尼考和大觀霉素耐藥率較低(圖1)。肉雞屠宰生產(chǎn)鏈不同環(huán)節(jié)沙門氏菌耐藥性差異較大(圖2)。屠宰加工生產(chǎn)鏈各環(huán)節(jié)沙門氏菌僅有分割雞肉產(chǎn)品對頭孢曲松表現(xiàn)出較低的耐藥率,雞糞和屠宰加工生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面分離的沙門氏菌均對頭孢曲松敏感;雞糞和分割雞肉產(chǎn)品沙門氏菌對氟苯尼考、慶大霉素和大觀霉素表現(xiàn)出較低的耐藥率,屠宰加工生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面的沙門氏菌對氟苯尼考、慶大霉素和大觀霉素均敏感;屠宰加工生產(chǎn)鏈各環(huán)節(jié)沙門氏菌對氨芐西林和環(huán)丙沙星耐藥的耐藥率較高,且耐藥率表現(xiàn)為分割雞肉產(chǎn)品>雞糞>屠宰生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面;屠宰加工生產(chǎn)鏈各環(huán)節(jié)沙門氏菌對四環(huán)素耐藥率較高,對阿莫西林/克拉維酸耐藥率較低,且耐藥率均表現(xiàn)為分割雞肉產(chǎn)品>屠宰生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面>雞糞;屠宰加工生產(chǎn)鏈各環(huán)節(jié)沙門氏菌對萘啶酸耐藥率均高達(dá)100%。

圖1 肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對10種抗生素的耐藥率(n=72)Fig.1 Resistance rate of Salmonella 10 antimicrobials from broiler slaughterhouse production chain(n=72)

圖2 肉雞屠宰生產(chǎn)鏈不同環(huán)節(jié)沙門氏菌耐藥性Fig.2 Drug resistance of Salmonella from different broiler slaughterhouse production chain

2.2 β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的流行

51株對頭孢曲松或氨芐西林或阿莫西林/克拉維酸耐藥的沙門氏菌中,50株同時擴(kuò)增到blaTEM和blaCMY-2基因,有1株只擴(kuò)增到blaTEM基因,表型耐藥與耐藥基因100%符合。其中,21株雞糞沙門氏菌同時擴(kuò)增到blaTEM和blaCMY-2基因;6株屠宰生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面沙門氏菌同時擴(kuò)增到blaTEM和blaCMY-2基因;24株分割雞肉產(chǎn)品沙門氏菌,有23株擴(kuò)增到blaTEM和blaCMY-2基因,只有1株擴(kuò)增到blaTEM基因(見表2)。

2.3 磺胺類耐藥基因的流行

39株對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥的沙門氏菌中,有36株擴(kuò)增到sul1或sul2或sul3基因,有3株未擴(kuò)增到sul1或sul2或sul3基因,耐藥表型與耐藥基因型符合率為92%。其中,15株雞糞沙門氏菌中,有3株擴(kuò)增到sul2基因,6株同時擴(kuò)增到sul2和sul3基因,6株同時擴(kuò)增到sul1、sul2和sul3基因;9株屠宰生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面沙門氏菌中,有7株擴(kuò)增到sul1或sul2或sul3基因,1株擴(kuò)增到sul2和sul3基因,6株同時擴(kuò)增到sul1、sul2和sul3基因;15株分割雞肉產(chǎn)品沙門氏菌中,有1株擴(kuò)增到sul2基因,5株擴(kuò)增到sul1和sul2基因,5株擴(kuò)增到sul2和sul3基因,3株擴(kuò)增到sul1、sul2和sul3基因(見表2)。

2.4 四環(huán)素耐藥基因的流行

37株對四環(huán)素耐藥的沙門氏菌中,有33株擴(kuò)增到tetA或tetB或tetC基因,表型耐藥與耐藥基因符合率為89.2%。其中,15株雞糞沙門氏菌中,5株僅擴(kuò)增到tetC基因,1株僅擴(kuò)增到tetB基因,3株同時擴(kuò)增到tetB和tetC基因;6株對屠宰生產(chǎn)環(huán)節(jié)肉雞胴體表面沙門氏菌全部同時擴(kuò)增到tetA、tetB和tetC基因;22株分割雞肉產(chǎn)品沙門氏菌中,1株僅擴(kuò)增到tetC基因,1株僅擴(kuò)增到tetB基因,1株擴(kuò)增到tetA和tetB基因,7株同時擴(kuò)增到tetB和tetC基因,8株同時擴(kuò)增到tetA、tetB和tetC基因(見表2)。

2.5 氟苯尼考耐藥基因的流行

4株對氟苯尼考耐藥的沙門氏菌中,有3株擴(kuò)增到flor基因,表型耐藥與耐藥基因符合率為75%。其中,1株雞糞沙門氏菌擴(kuò)增到flor基因;2株分割雞肉產(chǎn)品沙門氏菌擴(kuò)增到flor基因,1株分割雞肉產(chǎn)品未擴(kuò)增到flor基因(見表2)。

表2 沙門氏菌分離菌株耐藥基因檢測情況

2.6 慶大霉素耐藥基因的流行

10株對慶大霉素耐藥的沙門氏菌,有8株擴(kuò)增到aac(3)-Ⅱ或aac(3)-Ⅳ基因,耐藥表型與耐藥基因80%符合。其中,2株雞糞沙門氏菌中,只有1株擴(kuò)增到aac(3)-Ⅱ基因;7株分割雞肉產(chǎn)品沙門氏菌中,有1株擴(kuò)增到aac(3)-Ⅱ基因,6株同時擴(kuò)增到aac(3)-Ⅱ和aac(3)-Ⅳ基因(見表2)。

3 討論

3.1 沙門氏菌對抗生素的耐藥性

近年來,隨著抗生素的濫用,世界各地報道沙門氏菌耐藥性越來越強(qiáng),耐藥譜不斷擴(kuò)大。本實驗對72株沙門氏菌的耐藥性檢測顯示,沙門氏菌分離株對萘啶酸、氨芐西林、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、環(huán)丙沙星耐藥率較高,表明該肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌耐藥性不容樂觀。這與M?ka等[19],楊保偉等[20]結(jié)果相似,肉雞養(yǎng)殖場應(yīng)停止該類藥物的使用,可選擇性使用大觀霉素和慶大霉素,并建議使用阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、氟苯尼考。本實驗中,沙門氏菌對萘啶酸耐藥率最高,這可能與肉雞養(yǎng)殖過程中相應(yīng)抗生素的濫用有關(guān)。朱恒文等[21]、張瑋等[6]均表明沙門氏菌對抗生素的耐藥性最強(qiáng)與相應(yīng)抗生素的大量使用有關(guān)。同時,相關(guān)研究表明[22-23],細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生反映了畜禽養(yǎng)殖中抗生素的盲目使用。

本實驗中,肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對10種抗生素耐藥性存在較大差異,不存在耐藥率沿生產(chǎn)鏈降低的趨勢,沙門氏菌對四環(huán)素和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率沿肉雞屠宰生產(chǎn)鏈有所升高。侯小剛等[24]對四川主要肉品生產(chǎn)鏈中沙門氏菌的分離鑒定、耐藥性分析及PFGE分析表明,豬肉和鴨肉生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對萘啶酸、環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氟苯尼考、慶大霉素的耐藥率從養(yǎng)殖場到市場都有不同程度的降低,而對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑的耐藥率有所上升,表明豬肉和鴨肉生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對抗生素耐藥率不存在沿生產(chǎn)鏈降低的趨勢。

3.2 沙門氏菌耐藥基因流行

本實驗對5類抗生素表型耐藥的沙門氏菌攜帶相應(yīng)耐藥基因的檢測結(jié)果表明,總體上耐藥基因與耐藥表型的檢測結(jié)果基本一致,但在本實驗中有2株磺胺類、1株氟苯尼考和2株慶大霉素耐藥菌株中,均未檢測到相應(yīng)的耐藥基因,可能是攜帶其他耐藥基因或存在其他耐藥機(jī)制。趙玉林等[25]對雞源多重耐藥沙門氏菌耐藥基因的檢測,blaTEM-1、tetA和tetB基因檢出率最高,且耐藥表型與耐藥基因檢測結(jié)果基本一致。廖成水等[26]對雞源性致病性沙門氏菌新近分離株的耐藥性與耐藥基因研究中,有部分耐藥菌株未能檢測到相應(yīng)的耐藥基因,推測其可能是因為該菌株含有其他耐藥基因或存在其他耐藥機(jī)制。本實驗中,72株肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌,β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM和blaCMY-2;磺胺類sul2和sul3;四環(huán)素tetB和tetC;氨基糖苷類aac(3)-Ⅱ和aac(3)-Ⅳ;氟苯尼考flor檢出率≥75%,表明這些耐藥基因在該屠宰生產(chǎn)鏈中沙門氏菌較為普遍。不同國家,不同地區(qū)沙門氏菌流行情況及臨床抗生素使用習(xí)慣的不同,直接導(dǎo)致耐同種藥物的沙門氏菌攜帶的耐藥基因不同。李郁等[7]對屠宰生豬多重耐藥沙門氏菌耐藥基因的檢測,tetB、aph(3)-Ⅱa和flor基因檢出率較高。張瑋等[7]對健康豬直腸糞便中沙門氏菌耐藥基因的檢測,tetB、aph(3)-Ⅱa和cmlA基因檢出率較高。Ahmed A M等[27]對分離于埃及病雞肉中的多重耐藥沙門氏菌耐藥基因的檢測,blaTEM-1、blaCMY-2、flor、tetA基因檢出率較高。

沙門氏菌對喹諾酮類藥物耐藥主要是因為DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變,其次是目前研究較多的耐藥質(zhì)粒攜帶耐藥基因。郝宏珊等[28]對雞肉源沙門氏菌喹諾酮和氟喹諾酮類抗生素耐藥狀況及相關(guān)基因研究表明,四省市中雞肉源沙門氏菌耐藥狀況嚴(yán)重,其解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變及耐藥質(zhì)粒攜帶的耐藥基因是導(dǎo)致沙門氏菌對喹諾酮和氟喹諾酮類耐藥的重要機(jī)制。Laura J等[29]對英國動物源喹諾酮耐藥沙門氏菌gyrA和parC基因突變點(diǎn)檢查,196株沙門氏菌中,有194株沙門氏菌均檢測到gyrASer83或Asp87突變,未檢測到parC突變。林居純等[30]對食品動物源沙門氏菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因的檢測,菌株主要攜帶qnrB、aac(6′)-Ⅰb-cr及oqxAB基因的耐藥質(zhì)粒。因此,本實驗應(yīng)進(jìn)一步對DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變及耐藥質(zhì)粒攜帶的耐藥基因進(jìn)行檢測。

4 結(jié)論

沙門氏菌對常見抗生素具有不同程度的耐藥性,且耐藥基因普遍存在于耐藥菌株中,藥敏實驗結(jié)果與耐藥基因檢測結(jié)果有很高的一致性。

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Drug resistance gene detection and the resistance correlation analysis inSalmonellaisolated from broiler slaughterhouse production chain

LAI Hai-mei1,ZOU Li-kou3,LIU Shu-liang1,2,*,HAN Xin-feng1,2,ZHOU Kang1,2,LUO Pei-wen1,XIA Xiao-long1,LI Jian-long1

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering of Sichuan Province,Ya’an 625014,China;3.Lab of Microbiology,Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University,Dujiangyan 611830,China)

Objective:To understand the relationship between drug-resistant gene and drug resistance ofSalmonellaisolates from broiler slaughterhouse production chain. Method:The susceptibility testing of 72Salmonellastrains from broiler slaughterhouse production chain to 10 varieties of antibiotics were performed by means of K-B disc method and PCR technique was used to detect the presence of resistance gene in the corresponding drug-resistantSalmonellaisolated. Result:The nalidixic acid(100%)resistant rates ofSalmonellaisolated from broiler slaughterhouse production chain were the highest. The resistant rates of 72Salmonellaisolated to ampicilin,benzyl methyl oxygen/sulfamethoxzole,ciprofloxacin,tetracycline,gentamicin were 69.44%,54.17%,38.89%,34.72% and 13.89%,respectively. At least one antimicrobial resistance gene was detected in eachSalmonellaisolate and the following antimicrobial resistance genes were commonly present;the detection rates of the resistant strains ofblaTEM,blaCMY-2,sul2,sul3,tetBandtetCgenes were 96.08%,100%,94.87%,71.79%,78.38%,100%,respectively. Conclusion:These results implied that the resistantSalmonellaisolated from broiler slaughterhouse production chain to common antibiotics were different from each other,and resistant genes were widely existed in these resistant strains. Antimicrobial phenotypes ofSalmonellaisolates were very consistent with their genotypes(≥75%).

broiler slaughterhouse production chain;Salmonella;susceptibility testing;drug resistant genes

2014-06-30

賴海梅(1988-),女,碩士研究生,研究方向：食品微生物。

*通訊作者:劉書亮(1968-),男,博士,教授,研究方向：食品微生物與發(fā)酵工程。

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項子課題(200903055)。

TS201.6

A

1002-0306(2015)07-0187-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.031