紫外結(jié)合亞硝酸誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株

唐雪鷺,崔 春,雷芬芬,舒 會(huì),趙謀明,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣東省食品綠色加工與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 511400)

紫外結(jié)合亞硝酸誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株

唐雪鷺1,2,崔 春1,2,雷芬芬1,2,舒 會(huì)1,2,趙謀明1,2,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣東省食品綠色加工與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 511400)

為提高一株深海來(lái)源微小桿菌屬細(xì)菌Exiguobacteriumsp. SWJS2 產(chǎn)中性蛋白酶的酶活,本文先后采用紫外線和亞硝酸對(duì)其進(jìn)行誘變處理。紫外誘變條件為8W紫外燈在20cm處直接照射50s;三輪誘變后得突變株UV-48,其酶活較原始菌株提升21.32%。再以UV-48為出發(fā)菌株進(jìn)行亞硝酸誘變,條件為0.03mol/L亞硝酸作用8min;三輪誘變后得突變株HN-34,其酶活為1109U/mL,較突變株UV-48提升13.97%,較原始菌株提升38.28%。HN-34傳代5次相對(duì)酶活均在94%以上,遺傳性狀穩(wěn)定。

中性蛋白酶,誘變,紫外,亞硝酸,微小桿菌屬

中性蛋白酶是一類作用于蛋白質(zhì)肽鍵的水解酶,其在中性pH(6.0～7.5)條件下活力最高,并在食品加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,如飲料澄清[1]、風(fēng)味改善[2]、動(dòng)植物蛋白酶解[3]及其副產(chǎn)物的高值利用[4]等。此外,中性蛋白酶在皮革處理和飼料生產(chǎn)方面也有重要應(yīng)用。

常見(jiàn)的微生物蛋白酶以細(xì)菌[5](芽孢桿菌屬和假單胞菌屬)來(lái)源為主,也有來(lái)自放線菌(鏈霉菌屬[6])和真菌[7](曲霉、根霉和毛霉屬)等,但以細(xì)菌蛋白酶的酶反應(yīng)速率和穩(wěn)定性較好[8]。本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)南海深海海泥中篩選得到一株微小桿菌屬細(xì)菌,其產(chǎn)蛋白酶的基本酶學(xué)特性[9]如下:最適pH為7,并在pH5～9范圍內(nèi)穩(wěn)定;最適作用溫度40～45℃,活性受EDTA抑制明顯;40℃下保溫1h全部失活;屬中性中溫金屬蛋白酶,但熱穩(wěn)定性靠近低溫蛋白酶。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件[7]下該細(xì)菌所產(chǎn)中性蛋白酶的酶活可達(dá)802U/mL,相較其他產(chǎn)堿性蛋白酶且酶活不高的微小桿菌屬細(xì)菌[10-11],該菌株優(yōu)勢(shì)明顯。

紫外照射能在同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體,亞硝酸則可脫去堿基中的氨基。不同種類、劑量誘變劑的搭配使用效果不同[12],以上兩者的結(jié)合使用就已成功用于提高α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[13]、乳酸鏈球菌素[14]和ε-聚賴氨酸[15]等代謝物的產(chǎn)量。本文先后采用紫外線、亞硝酸進(jìn)行誘變處理,以期進(jìn)一步提高該深海菌株產(chǎn)中性蛋白酶的酶活,為其與陸生菌種所產(chǎn)蛋白酶在酶解方向的對(duì)比研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Exiguobacteriumsp. SWJS2 篩選自中國(guó)南海深海海泥,由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

酪氨酸 購(gòu)于sigma公司;酪蛋白(干酪素) 購(gòu)于上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司;高級(jí)海水素 購(gòu)于廣州海寶生物科技有限公司。其余化學(xué)試劑均為分析純。

試管斜面保藏培養(yǎng)基(g/L) 牛肉浸膏4,蛋白胨6,酵母浸出粉2,氯化鈉5,瓊脂5,pH7.2±0.1;液體種子培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨5,酵母浸出粉1,海水素33.3,pH7.2±0.1;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 甘油3,葡萄糖5,酵母浸出粉10,氯化鈉10,磷酸氫二鉀0.5,硫酸鎂0.3,硫酸銨1,氯化鈣1，pH7.2±0.1;篩選培養(yǎng)基(酪蛋白-瓊脂平板)(g/L) 酪蛋白10,牛肉浸膏3,氯化鈉5,磷酸氫二鉀2,瓊脂15,pH7.2±0.1。上述所有培養(yǎng)基的滅菌條件均為121℃,20min。

3-18k臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)sigma儀器公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HZQ-X300C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;XMTD-204電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設(shè)備廠;UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的建立

1.2.1.1 制備菌懸液 將保藏菌種Exiguobacteriumsp. SWJS2轉(zhuǎn)接至酪蛋白平板,3次劃線分離得純培養(yǎng)物。取一環(huán)接入液體種子培養(yǎng)基,180r/min、37℃搖床培養(yǎng)12h即得。

1.2.1.2 測(cè)定生長(zhǎng)曲線 以2%接種量將上述菌懸液接種于10mL液體種子培養(yǎng)基中(100mL錐形瓶),振蕩混勻后以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2h取出一瓶,立即放于4℃冰箱中保存[16]。24h結(jié)束后,以未經(jīng)接種的液體種子培養(yǎng)基為空白調(diào)零,于600nm波長(zhǎng)下測(cè)定各瓶菌液的吸光度值OD600。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600為縱坐標(biāo),繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 最適稀釋倍數(shù)的確定 以無(wú)菌生理鹽水對(duì)未經(jīng)誘變劑處理的菌懸液進(jìn)行十倍稀釋,以能使平板上的初始菌落總數(shù)在100～300之間者為最適稀釋倍數(shù)。誘變所需菌懸液采用相同稀釋倍數(shù)。

1.2.3 紫外(UV)誘變 取稀釋后的菌懸液100μL涂布酪蛋白平板。在黑暗條件下使涂布完成的平板于8W紫外燈正下方20cm處直接照射不同時(shí)間。照射前應(yīng)預(yù)熱20min穩(wěn)定紫外燈;照射達(dá)設(shè)定時(shí)間后關(guān)燈,每組設(shè)3個(gè)平行。所有平板37℃恒溫避光培養(yǎng)36h后取出計(jì)數(shù),以未經(jīng)照射的平板為對(duì)照,計(jì)算致死率。以紫外照射時(shí)間為橫坐標(biāo),致死率為縱坐標(biāo),繪制致死率曲線。

1.2.4 亞硝酸(HNO2)誘變

1.2.4.1 確定最適作用濃度 向盛有2mL菌懸液的滅菌錐形瓶中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L亞硝酸鈉溶液各1.0mL,立即加入7mL(0.5mol/L)pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(反應(yīng)所得HNO2的終濃度為0.01～0.05mol/L)?；旌弦河?7℃水浴保溫振蕩5min,各取500μL加入9.5mL(0.07mol/L)pH8.5磷酸氫二鈉溶液中,終止反應(yīng)。以不經(jīng)水浴保溫而立即振蕩均勻并稀釋至適宜倍數(shù)的菌懸液為空白對(duì)照,不同處理濃度各設(shè)一個(gè)對(duì)照。處理后的菌懸液稀釋至適宜倍數(shù),各取100μL涂布酪蛋白平板,每組設(shè)3個(gè)平行。所有平板37℃恒溫培養(yǎng)36h后取出計(jì)數(shù),計(jì)算致死率。由遺傳育種經(jīng)驗(yàn),選擇存活菌變異顯著且正變率較高的80%左右致死率[17],并以該致死率對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉溶液濃度為最適作用濃度。

1.2.4.2 確定最佳作用時(shí)間 選用最適作用濃度的亞硝酸鈉溶液,以1.2.4.1方法處理菌懸液,但將水浴保溫時(shí)間調(diào)整為1、2、3、4、5、6、7、8、9min,空白對(duì)照設(shè)置方法相同。以亞硝酸作用時(shí)間為橫坐標(biāo),致死率為縱坐標(biāo),繪制致死率曲線。

1.2.5 突變菌株的篩選

1.2.5.1 平板初篩 從致死率為80%～90%的酪蛋白平板上挑取菌落,劃線培養(yǎng)獲得單菌落后點(diǎn)種于酪蛋白平板,每組設(shè)3個(gè)平行。37℃恒溫培養(yǎng)36h后均勻滴入10%三氯乙酸(TCA)。選擇透明圈直徑與菌落直徑的比值(H/C值)較大的單菌落再次純化。

1.2.5.2 搖瓶復(fù)篩 初篩所得單菌落經(jīng)富集培養(yǎng),取500μL種子液接種至25mL發(fā)酵培養(yǎng)基(250mL錐形瓶),180 r/min、25℃搖床培養(yǎng)44h[9]。8000×g離心10min取上清液即得粗酶液。3次測(cè)定求平均值,選擇酶活最高的菌株再次誘變。

1.2.6 蛋白酶活力的測(cè)定 在特定條件下每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定義為1個(gè)單位(U)[18],本實(shí)驗(yàn)以福林法[19]測(cè)定粗酶液的酶活力。蛋白酶活力(U/mL)=ΔOD680×K×(4/10)×n。其中,ΔOD680為待測(cè)樣品與空白對(duì)照的吸光度差值;K為吸光系數(shù),即OD值為1.0時(shí)對(duì)應(yīng)的1mL酪氨酸的質(zhì)量,μg;本實(shí)驗(yàn)中K=97.7614;n為粗酶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將篩選所得突變菌株連續(xù)傳代5次,分別測(cè)其搖瓶發(fā)酵所得粗酶液的中性蛋白酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線

由圖1可知,菌株在接入種子培養(yǎng)基后延滯期較短,從第2h起進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并持續(xù)約8h。10～22h菌體數(shù)量穩(wěn)定,第24h表現(xiàn)出衰退特征。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的菌懸液,其菌體對(duì)理化因素較為敏感且大小均勻;較大的菌液濃度則能在一定程度上減少致死率誤差。綜合以上兩點(diǎn)選用種齡為12h的種子液進(jìn)行誘變處理。

圖1 菌株Exiguobacterium sp. SWJS2的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Exiguobacterium sp. SWJS2

2.2 紫外誘變結(jié)果

由圖2可知,紫外照射60s時(shí)菌體已接近完全死亡。前60s內(nèi)菌體死亡率與照射時(shí)間呈正相關(guān),50s時(shí)致死率可達(dá)80%。從該組平板分離單菌落進(jìn)行初篩和復(fù)篩,并將粗酶液酶活最高的菌株再次誘變。3輪誘變后所得結(jié)果見(jiàn)表1,可知酶活高低與H/C值的正相關(guān)性較弱;可能是由于菌株在固、液培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶能力不同[20]。突變株UV-48搖瓶發(fā)酵所得粗酶液的酶活為973U/mL,較原始菌株酶活802U/mL提高21.32%。將UV-48作為出發(fā)菌株進(jìn)行亞硝酸誘變。

圖2 致死率隨紫外照射時(shí)間的變化Fig.2 Death curve of ultraviolet mutation

菌株號(hào)H(cm)C(cm)H/C蛋白酶活(U/mL)酶活提升程度(%)原始菌株2.800.654.3802-UV-482.200.504.497321.32UV-412.500.406.395519.08UV-632.800.515.595018.45UV-582.550.604.393416.46UV-552.700.604.592815.71UV-452.400.415.991313.84UV-142.800.456.290412.72UV-532.500.604.590212.47

注：*H為水解圈直徑,C為菌落直徑,H/C為二者比值。

2.3 亞硝酸誘變結(jié)果

由圖3,UV-48經(jīng)0.03mol/L HNO2作用5min后致死率接近80%,故以0.03mol/L為亞硝酸誘變的最適濃度(對(duì)應(yīng)亞硝酸鈉溶液的濃度為0.3mol/L)。以最適濃度作用不同時(shí)間所得的致死率曲線如圖4,亞硝酸作用8min后致死率達(dá)80%以上。從該組平板分離單菌落進(jìn)行初篩和復(fù)篩,并將粗酶液酶活最高的菌株再次誘變。3輪誘變后所得結(jié)果見(jiàn)表2。突變菌株HN-34的酶活較該菌株UV-48提高13.97%,較原始菌株提高38.28%。

圖3 致死率隨亞硝酸作用濃度的變化Fig.3 Relationship between lethality and the concentration of HNO2

圖4 致死率隨亞硝酸作用時(shí)間的變化Fig.4 Relationship between lethality and the action time of HNO2

菌株號(hào)H(cm)C(cm)H/C蛋白酶活(U/mL)酶活提升程度(%)UV-482.200.504.4973-HN-342.700.604.5110913.97HN-402.550.653.9110513.57HN-442.500.604.210669.56

注：*H為水解圈直徑,C為菌落直徑,H/C為二者比值。

2.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將HN-34連續(xù)傳代5次,測(cè)定各代菌株搖瓶發(fā)酵所得粗酶液的中性蛋白酶酶活。由表3可知,蛋白酶活并不嚴(yán)格隨傳代次數(shù)的增加而減少,而是表現(xiàn)出一定的波動(dòng)性,但各代菌株所產(chǎn)蛋白酶的相對(duì)酶活比較接近并均在94%以上。整體而言突變菌株HN-34酶活穩(wěn)定,結(jié)果的波動(dòng)性可能源于除培養(yǎng)基組成、溫度、時(shí)間和轉(zhuǎn)速以外其他因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

3 結(jié)論

深海菌株Exiguobacteriumsp. SWJS2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始于第2h并持續(xù)約8h,穩(wěn)定期時(shí)長(zhǎng)12h,與陸生細(xì)菌同中存異,二者酶解效果的差異值得進(jìn)一步研究。紫外誘變將該細(xì)菌所產(chǎn)中性蛋白酶的酶活提升21.32%,亞硝酸誘變?cè)偬嵘?3.97%,最終較原始菌株提升38.28%;但提升程度不及已報(bào)道的其他菌種的代謝產(chǎn)物(50%以上至數(shù)倍)。分析原因可能有以下五點(diǎn):其一,微小桿菌屬為革蘭氏陽(yáng)性菌,厚密的細(xì)胞壁使其對(duì)于紫外線和亞硝酸作用的耐受能力較革蘭氏陰性菌更強(qiáng);其二,合成機(jī)制不同的代謝產(chǎn)物對(duì)于誘變劑的作用效果存在差異;其三,原始菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶活遠(yuǎn)高于其他已報(bào)道的微小桿菌屬細(xì)菌,其本身的酶活提升程度有限;其四,兩種誘變劑的分開(kāi)使用對(duì)于細(xì)菌基因的改造程度不及二者的復(fù)合作用;其五,3輪誘變尚不足以獲得可觀的提升程度。因而,換用其他種類誘變劑和其相互之間的搭配使用方式并適當(dāng)增加誘變輪數(shù),將有可能獲得更高的酶活提升程度。除與陸生菌種蛋白酶酶解效果的對(duì)比研究外,后續(xù)還可關(guān)注該細(xì)菌蛋白酶與同屬其他種細(xì)菌蛋白酶酶學(xué)特性的異同。

表3 突變株HN-34的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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Study on the screening high yield neutral-protease-producing strain by combing UV and nitrous acid mutagenesis

TANG Xue-lu1,2,CUI Chun1,2,LEI Fen-fen1,2,SHU Hui1,2,ZHAO Mou-ming1,2,*

(1.School of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Food Green Processing and Nutrition Regulation Technologies Research Center,Guangzhou 510640,China)

UV and HNO2were successively used to promote the enzyme-activity of the neutral protease produced by a marine bacteriaExiguobacteriumsp. SWJS2. Being directly exposed to 8W UV for 50s with a vertical dimension of 20cm,mutant strain UV-48 with a promotion of 21.32% were obtained after three turns of mutagenesis and then be applied into HNO2mutagenesis for further promotion. Being diluted by 0.03mol/L HNO2for 8min,UV-48 was finally turned into HN-34 with a promotion of 13.97% than itself and 38.28% than the starting strain after three turns. After pass-generation tests for five times,the mutant strain HN-34 was proved to be genetically stable since the five relative enzyme-activity were all above 94%.

neutral protease;mutagenesis;UV;nitrous acid;Exiguobacteriumsp.

2014-07-14

唐雪鷺(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù)。

*通訊作者:趙謀明(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術(shù),蛋白質(zhì)深加工技術(shù)。

深海微生物活性物質(zhì)挖掘與其利用技術(shù)(2012AA092104);廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)(GD2012-D01-002);熱帶海洋微生物新型耐鹽特異性蛋白酶的挖掘與應(yīng)用(2013418018-7)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0163-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.026