靶向阻斷轉(zhuǎn)化生長因子-β 信號通路對腫瘤特異性細胞毒性T 淋巴細胞的影響

田 豐，周 凱，車曉玲，傅 點，程 文，周文泉，張征宇，秦衛(wèi)軍，王龍信

0 引 言

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種具有多種功能的細胞因子，其對免疫細胞有強大的免疫抑制作用，能夠被多數(shù)腫瘤大量分泌而逃避宿主的免疫監(jiān)視［1］。CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是機體針對腫瘤免疫的重要的效應細胞，但由于TGF-β 的免疫抑制功能，其作用被明顯抑制［2］。我們構(gòu)建了對TGF-β 不敏感的腫瘤特異性的CTL 細胞，通過檢測對比CTL 對腫瘤細胞的細胞毒性作用及小鼠體內(nèi)細胞因子的變化了解TGF-β 信號通路被阻斷后免疫細胞的治療作用的變化?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性Balb/c 小鼠，體重:16 ～20g，鼠齡:6 ～8 周，共60 只，購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物合格證號:SCXK(軍)2008-016。飼養(yǎng)于超凈動物實驗室層流架內(nèi)，保持恒溫(25±2)℃、恒濕(45%～50%)，應用實驗動物標準飲食進行飼養(yǎng)，無菌工作臺內(nèi)進行實驗操作。

1.1.2 細胞 小鼠腎癌細胞系Renca、前列腺癌細胞系TRAMP-C2 購自于ATCC 公司，以10%FCS PRMI1640 于pH 7.2 ～7.4、37 ℃、5%CO2、100%濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以細胞平鋪生長至培養(yǎng)瓶底面積80%為標準。

1.1.3 主要藥品及試劑 修飾的TβRⅡ質(zhì)粒由美國西北大學張強博士惠贈。粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)及白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、IL-2均購于英國Peprotech 公司。DMEM、1640 培養(yǎng)基購于Gibco 公司。胎牛血清(FBS)購于Hyclone公司。抗Smad-2 和磷酸化Smad-2 的單克隆抗體購自BD Pharmingen 公司。CD8+T Cell Isolation Kit 購自R＆D 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 于小鼠右腋部皮下注射0.1 mL(5×106個/L)Renca 細胞懸液，1 周后腫瘤大小接近10 ～20 mm，建立腎癌皮下荷瘤Balb/c 小鼠模型。

1.2.2 DC 細胞分離、培養(yǎng)及抗原負載 頸椎脫位處死小鼠，無菌取脾，用梯度密度離心法獲取單個核細胞，調(diào)整細胞密度至5×109個/L，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 h，移去懸浮細胞，加入含10%FCS 的1640 培養(yǎng)液、rm-IL-4(1000 U/mL)、rm-GM-CSF(1000 U/mL)，隔日半量換液，第5 天后按10∶1 比例加入反復凍融獲得Renca 細胞裂解物，第6 天加入TNF-α，第7 天收集懸浮細胞，即為負載腎癌抗原的DC 細胞(TP-DC)。

1.2.3 CTL 細胞分離、培養(yǎng)及致敏 頸椎脫位處死Balb/c 小鼠，無菌取脾，制備脾細胞懸液，去除細胞團或碎片并裂解紅細胞。清洗細胞并計數(shù)，將脾細胞置于冷的1×MagCellectBuffer 中，將細胞數(shù)調(diào)整至20×107個/mL;將細胞轉(zhuǎn)移至5mL 離心管中，加入200 μL/mL MagCellectCD8+Cocktail，2 ～8 ℃冰箱孵育15 min;向細胞懸液中加入250 μL MagCellect Ferrofluid，2 ～8 ℃冰箱孵育15 min;孵育后期向試管中加入1.55 mL 1×MagCellectBuffer 使反應容積達到3 mL，將反應試管水平放置于磁力架上，室溫(18 ～25 ℃)孵育6 min;保存離心管于磁場中，將上清移至5 mL 離心管中，重復最后步驟獲得CD8+CTL 細胞。應用流式細胞儀進行鑒定。將TP-DC與CTL 以1∶10 比例加入含IL-2(500 U/mL)的10%FCS 1640 培養(yǎng)基中共同孵育，獲得腫瘤敏感的CTL細胞(tumor pulsed cytotoxic T lymphocyte，TP-CTL)。

1.2.4 TβRⅡ質(zhì)粒構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 在FuGENE 6 作用下用修飾的TβRⅡ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 包裝細胞，32 ℃下孵化24 h 后收集漂浮在表面的病毒，0.45 μm過濾器過濾，在聚凝胺作用下轉(zhuǎn)染293 細胞，32 ℃下孵化48 h，10%DMEM 培養(yǎng)基37 ℃下孵化過夜，同樣條件再次轉(zhuǎn)染293 細胞24 h，收集漂浮在表面的病毒，0.45 μm 過濾器過濾，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。

1.2.5 阻斷TGF-β 信號通路的腫瘤特異性CTL 細胞的獲得 已經(jīng)致敏的TP-CTL 細胞(1×106個/mL)置于預涂纖維蛋白碎片的培養(yǎng)基內(nèi)，加入同樣體積的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，5%CO2、37 ℃下孵化48 h，獲得表達顯性負相TGF-βⅡ型受體的腫瘤特異性的CTL細胞(TGF-β type Ⅱreceptor domain negative-CTL，TβRⅡDN-CTL)。

1.2.6 TβRⅡDN-CTL 細胞體外實驗 用TGF-β1(10 ng/mL)對TP-CTL 及TβRⅡDN-CTL 細胞進行增殖抑制實驗，進行細胞計數(shù)。用10 ng/mL 的TGF-β 與轉(zhuǎn)染前后的TβRⅡDN-CTL 細胞孵育16 h后裂解細胞，用抗Smad-2 和磷酸化Smad-2 的單克隆抗體做Western blot 檢測。通過Cr51釋放實驗測定TP-CTL 及TβRⅡDN-CTL 對腎癌細胞的細胞毒作用，靶效比(T 細胞/腫瘤細胞)從1∶1 至100∶1，以無關腫瘤細胞株小鼠前列腺癌TRAMP-C2 細胞作為非特異性對照。

1.2.7 TβRⅡDN-CTL 細胞對小鼠體內(nèi)IL-2 和INF-γ水平的影響 將已成瘤的動物模型按隨機數(shù)字表法分為2 組，每組10 只。分別于第1、3、7 天于尾靜脈過繼性注射TP-CTL 及TβRⅡDN-CTL 2×106個/只。3 周后應用ELISA 法檢測小鼠體內(nèi)IL-2 和INF-γ 水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 12.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差)表示，組間均數(shù)比較采用單因素的方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離獲得的DC、CTL 細胞及TβRⅡDN 轉(zhuǎn)染效率檢測 倒置顯微鏡下可見分離獲得的CTL 大小均勻小球形，而新鮮分離培養(yǎng)的DC 可見懸浮球形細胞表面有樹突狀或毛刺狀突起，見圖1。經(jīng)流式細胞儀檢測CTL 的TβRⅡDN 轉(zhuǎn)染效率為92.3%。見圖2。

2.2 TGF-β 對TβRⅡDN-CTL 細胞增殖影響 將正在培養(yǎng)的阻斷TGF-β 信號通路的TβRⅡDN-CTL 及TP-CTL 培養(yǎng)基中加入TGF-β1(10 ng/mL)，觀察2 種細胞的增殖情況，結(jié)果表明TGF-β1對TβRⅡDN-CTL細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖3。

2.3 阻斷TGF-β 信號通路后Smad-2 磷酸化情況

TP-CTL 細胞與TGF-β1以10 ng/mL 共同孵育16 h 后可以檢測到Smad-2 和磷酸化Smad-2。而轉(zhuǎn)染后表達TβRⅡDN 的CTL 細胞與同樣劑量TGF-β1孵育后只能檢測到Smad-2，而未檢測到磷酸化的Smad-2，說明TGF-β 的信號通路被阻斷。見圖4。

圖1 倒置顯微鏡下觀察分離獲得的CTL 及DC 細胞Figure 1 Cytotoxic T lymphocytes and dendritic cells under the inverted microscope

圖2 流式細胞儀檢測TβRⅡDN 轉(zhuǎn)染效率Figure 2 Transfection efficiency of TβRⅡDN by flow cytometry

圖3 TGF-β1對TP-CTL 和TβRⅡDN-CTL 細胞增殖數(shù)量的影響Figure 3 Effects of TGF-β1 on the proliferation of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes (TPCTLs)and TβRⅡDN-CTLs

圖4 Western blot 檢測不同CTL 細胞Smad-2 及其磷酸化情況Figure 4 hosphorylation of Smad-2 in tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDN-CTLs

2.4 TGF-β 信號通路對CTL 殺傷能力的影響TP-CTL 和TβRⅡDN-CTL 對腎癌Renca 細胞均有特異性的細胞毒作用，且殺傷率隨著E/T 比率的增加而升高，TβRⅡDN-CTL 對靶細胞的細胞毒作用與TP-CTL 比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。TβRⅡDN-CTL 及TP-CTL 對無關的小鼠前列腺癌TRAMPC2 細胞無明顯殺傷作用。見表1、表2。

表1 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對相關腫瘤細胞Renca 特異性殺傷效率，%)Table 1 Renal cancer-specific killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDNCTLs，%)

表1 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對相關腫瘤細胞Renca 特異性殺傷效率，%)Table 1 Renal cancer-specific killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDNCTLs，%)

與TβRⅡDN-CTL 組比較，*P ＜0.01

組別1∶1 20∶1不同效5靶0∶比1殺傷率75∶1 100∶1 TTβP-RCⅡTLD 組N- CT L 組 8 4..55 00±±00..55 84 *11 6..57 00±±00..84 22 *31 20..62 00±±30..0943 *41 14..49 00±±41..01 6 2*51 07..47 00±±41..44 8 2*

表2 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對無關腫瘤細胞TRAMP-C2 殺傷效率，%)Table 2 Killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDN-CTLs on non-tumor cells TRAMP-C2，%)

表2 TβRⅡDN-CTL 與TP-CTL 對無關腫瘤細胞TRAMP-C2 殺傷效率，%)Table 2 Killing effects of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes(TP-CTLs)and TβRⅡDN-CTLs on non-tumor cells TRAMP-C2，%)

組別1∶1 20∶1不同效5靶0∶比1殺傷率75∶1 100∶1 TβRⅡDN-CTL 組 1.20±0.09 2.30±0.11 3.50±0.17 4.20±0.25 7.30±0.31 TP-CTL 組 0.70±0.05 1.10±0.08 1.50±0.10 1.80±0.11 2.30±0.15

2.5 CTL 過繼性免疫后小鼠體內(nèi)細胞因子變化情況 過繼性輸注TP-CTL 和TβRⅡDN-CTL 荷瘤小鼠體內(nèi)檢測IL-2 和INF-γ 水平相比，TβRⅡDN-CTL較TP-CTL 升高更為明顯(P ＜0.01)。見圖5。

圖5 過繼性免疫后荷瘤小鼠體內(nèi)INF-γ 和IL-2 水平Figure 5 Levels of serum IL-2 and INF-γ in the tumorbearing mice after adoptive transfusion of tumor lysate-pulsed cytotoxic T lymphocytes (TPCTLs)and TβRⅡDN-CTLs

3 討 論

過繼性免疫治療是腫瘤免疫治療中一種有前景的治療方法，在動物實驗和臨床實驗中都已經(jīng)被廣泛證實有效［3］。機體中最終消滅腫瘤細胞的免疫細胞是CTL 細胞。在過繼性免疫治療中很多類型的免疫細胞都被應用過，包括淋巴因子激活的CTL細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞等，并且取得了一定的療效［4－7］。盡管免疫細胞對腫瘤能夠產(chǎn)生殺傷作用，但腫瘤很多的免疫逃逸機制仍然能夠超過這些免疫反應最終促進腫瘤進展［8－9］。腫瘤來源的免疫抑制因子是其中最重要的因素之一［10－11］。

TGF-β 是一種多效的細胞因子，具有重要的生理功能。同時TGF-β 也是腫瘤產(chǎn)生的一種強大的免疫抑制因子［1］，能夠明顯抑制免疫細胞的活性達到逃避殺傷的目的［2，10］。它能通過TGF-β/Smad 信號通路來影響細胞核內(nèi)的靶基因，從而顯著抑制CTL 殺傷活性［12］。首先TGF-β 與CTL 細胞表面的Ⅱ型受體(TβRⅡ)結(jié)合，通過磷酸化使下游細胞質(zhì)中的Smad 蛋白被激活。Smad 蛋白是TGF-β 受體復合物的下游信號調(diào)節(jié)蛋白，它可以把胞膜上的信號直接傳導至細胞核，活化了的Smads 復合物進入細胞核后，聯(lián)合細胞核內(nèi)其他的轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄來影響細胞周期［13－14］，從而影響CTL 的殺傷效率。本實驗將TβR Ⅱ基因在cDNA 597nt 處切去頂端，然后轉(zhuǎn)染給CTL 細胞，使TβRⅡ顯性負向表達來阻斷該信號通路的信號轉(zhuǎn)導，以達到消除TGF-β 對CTL 影響的作用。實驗證實由于阻斷了信號通路，在TβRⅡDN-CTL 中Western blot沒有檢測出磷酸化的Smad-2。在增殖抑制實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β 對TβRⅡDN-CTL 細胞增殖沒有明顯影響，從另外一個角度證實信號轉(zhuǎn)導通路被阻斷。當免疫抑制因子的影響被消除后，免疫細胞對腫瘤的殺傷作用將明顯提高。在本實驗中，阻斷TGF-β信號通路的CTL 細胞特異性的腫瘤殺傷效率明顯提高，而且將其過繼性回輸給荷瘤小鼠后，小鼠體內(nèi)的IL-2 和INF-γ 水平也明顯上升。IL-2 和INF-γ 均可由CTL 分泌，同時也對CTL 起到激活的作用，這對CTL 的殺傷效率提高起到作用［15］。本研究結(jié)果證實，阻斷CTL 的TGF-β 的信號通路，明顯提高腫瘤反應性CTL 的殺傷效率，并同時提高體內(nèi)免疫因子的水平。

通過將腫瘤反應性CTL 應用包含顯性負相TβRⅡ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染而使其TGF-β 信號被阻斷，實現(xiàn)了CTL 對腫瘤分泌的強效免疫抑制因子TGF-β 不敏感，從而顯著提高CTL 的殺傷效率。這種新方法對過繼性腫瘤免疫治療提供了新思路，具有重大的臨床意義與應用價值。

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