影響安徽省皖南地區(qū)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的TGF-β 通路候選基因關(guān)聯(lián)研究

沈麗娟，鐘芳芳，吳平平，曹曉智，盧林明

0 引 言

結(jié)直腸癌作為嚴(yán)重威脅人類健康、影響患者生活質(zhì)量的惡性腫瘤之一［1］，位列我國常見癌癥第5位，5 年生存率為60%左右［2］。近些年來發(fā)病率持續(xù)攀升，臨床上以手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療作為主要的治療方式，技術(shù)較為成熟，即便如此，結(jié)直腸癌術(shù)后患者疾病復(fù)發(fā)率及死亡率仍然很高，預(yù)后情況不好。此外，臨床上也發(fā)現(xiàn)，即使處于同樣的疾病狀態(tài)，給予相同治療的一些患者，其預(yù)后也往往千差萬別。國外研究表明，結(jié)直腸癌預(yù)后與一些遺傳基因位點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)，提示遺傳基因可能是影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后的因素之一［3-4］。

基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)廣泛存在于人體的基因組中，是可以用來識(shí)別、定位與目標(biāo)疾病相關(guān)的基因的第3 代遺傳標(biāo)記，近年來被廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病的研究中。大量SNP 位點(diǎn)已被證明與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)(genome-wide association study，GWAS)，但關(guān)于預(yù)后的研究則較少。一項(xiàng)美國人群的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化生長因子β 通路(TGF-β)上部分SNP 位點(diǎn)與結(jié)直腸癌預(yù)后顯著相關(guān)，提示TGF-β 通路可能是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的分子通路［5］，由于不同人種存在明顯的遺傳差異性，中國人群中是否能獲得相同結(jié)論仍是未知，因此，本研究選取我國結(jié)直腸癌患者樣本進(jìn)行SNP 關(guān)聯(lián)分析，以確定與我國結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，從而為根據(jù)不同遺傳易感性的結(jié)直腸癌患者提供不同的治療方案起到一定的指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院及皖南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013 年1 月至2014 年4 月經(jīng)病理檢查確診的I 期、Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，排除家族性腺瘤息肉、遺傳性息肉性結(jié)直腸癌及具有親緣關(guān)系患者后，共有52 例納入研究，其中男30 例，女22例，結(jié)腸癌22 例，直腸癌30 例，平均年齡(58.03±8.07)歲。腫瘤組織分化分級(jí)根據(jù)WHO 分類，癌組織中分化者37 例，中低分化等12 例，低分化者3 例;有淋巴轉(zhuǎn)移16 例，無淋巴轉(zhuǎn)移36 例。Ⅲ期結(jié)直腸癌患者帶有關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs10749971 的AC+AA 位點(diǎn)和rs961253 的CC 位點(diǎn)的為攜帶不利基因，如患者2 個(gè)位點(diǎn)都不是不利基因型的患者為低風(fēng)險(xiǎn)組，有1 個(gè)位點(diǎn)是不利基因型的患者為中等風(fēng)險(xiǎn)組，2 個(gè)位點(diǎn)都是不利基因型的患者為高風(fēng)險(xiǎn)組。全部患者隨訪期12 個(gè)月。

1.2 研究方法

1.2.1 研究位點(diǎn)篩選 選擇以往研究證明的與結(jié)直腸腺癌預(yù)后相關(guān)的TGF-β 通路獨(dú)立基因位點(diǎn)，并NCBI 的SNP 數(shù)據(jù)庫查詢(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)位點(diǎn)信息，選取其中在中國人群中最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)＞0.1、且分型成功的SNPs，最終共5 個(gè)SNPs 納入研究，詳見表1。

表1 納入研究SNP 位點(diǎn)信息Table 1 SNPs locus information included in the study

1.2.2 研究指標(biāo)及方法 收集患者年齡、性別、癌癥分期、癌癥分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移情況及癌癥位置等信息。DNA 樣本提取自患者癌組織蠟塊切片，SNP分型采用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的ABI7500 全自動(dòng)熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測。具體方法:①標(biāo)本處理:將全部入選患者的病理活檢癌組織進(jìn)行石蠟包埋后切片保存;②提取DNA:采用德國QIAGEN 石蠟組織DNA 提取試劑盒，柱提法提取DNA，具體步驟參考文獻(xiàn)［6］;③SNP 分型方法:采用ABI7500 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)平臺(tái)對(duì)提取的DNA 進(jìn)行基因分型，采用TaqMan 探針實(shí)時(shí)定量熒光PCR 方法檢測(ABI7500 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 儀)基因分型結(jié)果。PCR 反應(yīng)總體積10 μL，反應(yīng)條件:95 ℃變性10 min，92 ℃15 s，60 ℃60 s，循環(huán)40 次。陰性對(duì)照模板為滅菌蒸餾水，雙盲操作實(shí)驗(yàn)。結(jié)果由PCR 儀自動(dòng)判讀，各SNP 的PCR 分型聚類結(jié)果清晰，噪音較少。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 及SAS 9.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2 組間均數(shù)的比較采用t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2或Fisher 確切概率法;單個(gè)SNP 對(duì)結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)率及生存率影響的風(fēng)險(xiǎn)比采用時(shí)協(xié)變量的Cox 回歸分析。采用Haploview4.2 軟件進(jìn)行基因型的Hardy-Weinberg 平衡(HWE)檢驗(yàn)。以P≤0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 死亡患者較未死亡患者年齡偏大(P=0.005)，而復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者的特征比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者基本特征Table 2 Characteristics of 52 colorectal cancer patients

2.2 基因多態(tài)性與Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)分析 遺傳模型為隱形、加性模型時(shí)，POU2AF1 基因rs10749971 位點(diǎn)A 等位基因可顯著增加Ⅲ期患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(HR=1.968，P=0.004;HR=2.174，P=0.010);加性模型時(shí)，POU2AF1 基因rs10749971 位點(diǎn)A 等位基因可顯著增加Ⅱ期患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(HR=2.288，P=0.017);隱形遺傳模型時(shí)，BMP2 基因rs961253 位點(diǎn)C 等位基因顯著增加Ⅲ期患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(HR=1.992，P=0.005)。見表3。

2.3 基因多態(tài)性與Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)直腸癌生存關(guān)聯(lián)分析 顯性遺傳模型時(shí)，SMAD7 基因rs4464148 位點(diǎn)A 等位基因降低Ⅱ期及Ⅲ期患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)(HR=0.382，P=0.017;HR=0.230，P=0.006);而隱性遺傳模型時(shí)，BMP2 基因rs961253 位點(diǎn)C 等位基因則可顯著增加Ⅲ期患者死亡風(fēng)險(xiǎn)(HR=3.161，P=0.007)，見表4。

2.4 結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)基因型的累積效應(yīng) Ⅲ期結(jié)直腸癌患者不利基因的累積效應(yīng)與患者生存預(yù)后存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P=0.029)，低風(fēng)險(xiǎn)組至高風(fēng)險(xiǎn)組3 組的復(fù)發(fā)率分別為11.5%，20.0%及33.3%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.164)。3 組生存率分別為96.2%、45.0%、50%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)，高風(fēng)險(xiǎn)組可顯著增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)(HR=15.512，95%CI=1.611 ～149.360)。30 個(gè)月之后，高風(fēng)險(xiǎn)組的生存率降至50%左右(P=0.004)。復(fù)發(fā)生存曲線存在交叉，引入時(shí)間協(xié)變量的模型評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌相關(guān)基因型的累積效應(yīng)對(duì)復(fù)發(fā)的影響，結(jié)果顯示，加入時(shí)間交互項(xiàng)納入模型后結(jié)直腸癌相關(guān)基因型的累積效應(yīng)對(duì)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的生存分析結(jié)果仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表5，圖1。

表3 TGF-β 通路SNPs 與結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)情況相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis of SNPs in TGF-β pathway and the recurrence risk of colorectal cancer patients

表4 TGF-β 通路SNPs 與結(jié)直腸癌患者生存情況相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of SNPs in TGF-β pathway and the survival of colorectal cancer patients

表5 累積不利基因型對(duì)Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響Table 5 Prognostic effects of cumulative adverse genotypes on Stage Ⅲcolorectal cancer patients

圖1 不利基因型累積效應(yīng)對(duì)Ⅲ期結(jié)直腸患者癌復(fù)發(fā)及死亡的生存曲線分析Figure 1 Survival curve analysis on the cumulative effects of adverse genotypes on the recurrence(A)and death(B)of Stage Ⅲcolorectal cancer patients

3 討 論

關(guān)于結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)基因的研究很少，由于遺傳基因研究具有極為明顯的種群特異性，因此在中國人群中的研究極為重要。TGF-β 通路因被認(rèn)為與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)而頗受關(guān)注，一些大型全GWAS 研究及Meta 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)的多個(gè)與結(jié)直腸癌相關(guān)的SNP 位點(diǎn)皆位于TGF-β 通路上［7-13］，提示TGF-β 通路與結(jié)直腸癌易感性存在關(guān)聯(lián)?；谠摪l(fā)現(xiàn)，Dai 等［5］在美國人群中開展的GWAS 研究首次發(fā)現(xiàn)TGF-β 通路上SNP 位點(diǎn)與結(jié)直腸癌預(yù)后顯著相關(guān)，對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后遺傳研究具有重大意義。然而，該結(jié)論是完全建立在美國人群樣本上得出的，中國人群能獲得相同結(jié)論仍有待進(jìn)一步研究。因此本研究同樣選取TGF-β 通路上SNP 位點(diǎn)，首次在中國人群中分析與結(jié)直腸癌的預(yù)后相關(guān)的SNP，以了解可能影響中國人群結(jié)直腸癌患者預(yù)后的遺傳因素。由于結(jié)直腸癌Ⅱ期及Ⅲ期患者樣本易于獲得，且能滿足長期隨訪要求，因此本研究僅選取了Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)直腸癌患者。本研究結(jié)果顯示，TGF-β 通路上POU2AF1 的SNP rs10749971 的A 等位基因可增加Ⅲ結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，與美國人群隱形遺傳模型不同，本研究中該位點(diǎn)在加性模型下也顯示與疾病預(yù)后相關(guān)。BMP2 基因SNP rs961253 的C 等位基因在隱性遺傳模型下可同時(shí)增加Ⅲ期結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)，SMAD7 基因SNP rs4464148 的A等位基因在顯性模型下可降低Ⅲ期結(jié)直腸癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果與美國人群研究一致［14］。本研究中未發(fā)現(xiàn)與Ⅱ期結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的位點(diǎn)，可能由于本研究樣本量較小，檢驗(yàn)效能不足以發(fā)現(xiàn)差異導(dǎo)致，也可能是由于之前的研究結(jié)果未進(jìn)行校正，而本研究中所采用的Bonferroni 多重校正法過于保守導(dǎo)致。

本研究在中國人群中證明了位于TGF-β 通路的POU2AF1、BMP2 及SMAD7 基因SNP 位點(diǎn)與Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，GREM1、BMP2 和SMAD7 皆是TGF-β 通路的信號(hào)分子，進(jìn)一步證明了該通路可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用［15］。TGF-β 家族主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β 類(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白類(BMPs)和激活素類，其中TGF-β 是一種極強(qiáng)的抑制正常上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞生長的細(xì)胞抑制劑。有生物學(xué)研究顯示，在這些細(xì)胞中加入含TGF-β1 的培養(yǎng)基，可明顯阻止細(xì)胞復(fù)制［16］。因此，在結(jié)直腸癌患病早期，TGF-β 可以通過抑制結(jié)腸上皮腫瘤細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡來抵御疾病的發(fā)展［13］。但隨著腫瘤進(jìn)展，TGF-β 誘導(dǎo)的生長抑制作用往往會(huì)減弱甚至喪失［17］。這種功能的喪失可能與通路上的信號(hào)分子相關(guān)基因突變相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)一些位于TGF-β 通路上的基因在結(jié)直腸癌發(fā)生時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的突變，使癌細(xì)胞對(duì)該通路的抑制作用不再敏感［18］。這些研究說明了TGF-β 通路基因突變與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)的原因。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ 家族的TGF-β1 含量與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率正相關(guān)［19］，提示TGF-β 通路基因突變對(duì)該通路功能的影響對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后也存在一定影響。BMPs 類屬于TCF-β 超家族一員，研究發(fā)現(xiàn)BMP2 基因也參與結(jié)腸癌對(duì)機(jī)體的侵襲［20］。SNPs rs961253 距離BMP 基因很近，其突變可提示該基因的而變化。此外，SMAD7 基因雙倍表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良存在影響［21］，本研究發(fā)現(xiàn)SMAD7 基因SNP 位點(diǎn)突變與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步暗示該基因與疾病的關(guān)聯(lián)。然而，關(guān)于這些基因突變?nèi)绾巫饔糜诖x通路，進(jìn)一步影響結(jié)直腸癌患者疾病發(fā)生發(fā)展，還需要從更多層面上開展生物功能實(shí)驗(yàn)研究予以確認(rèn)。

腫瘤作為一種復(fù)雜性疾病，其發(fā)生發(fā)展收到多種遺傳因素及環(huán)境因素的共同作用［22-23］，因此本研究首次在中國患者中進(jìn)行了結(jié)直腸癌預(yù)后的SNP關(guān)聯(lián)研究，采用多種遺傳模型進(jìn)行分析，結(jié)果較為全面可靠，具有一定意義。在生存分析過程中發(fā)現(xiàn)，不利基因型累積效應(yīng)對(duì)Ⅲ期結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier 曲線出現(xiàn)交叉，為使結(jié)果更加可靠，本研究采用了引入時(shí)間交互作用項(xiàng)的非比例Cox 風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。然而，本研究基因位點(diǎn)選擇相對(duì)少，可能影響疾病預(yù)后的環(huán)境因素未能充分得以考慮，以及遺傳統(tǒng)計(jì)方法仍存在一定的局限性，因此仍需要更大樣本量、更多基因位點(diǎn)的大型研究對(duì)結(jié)果予以進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究采用候選基因方法，在中國人群中回顧性隨訪了Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后情況，評(píng)價(jià)遺傳基因SNP 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。結(jié)果從一定程度上驗(yàn)證了前人的結(jié)果，也發(fā)現(xiàn)中國人群的不同之處，關(guān)于人群遺傳基因的研究結(jié)果，仍需要生物功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，為實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者治療個(gè)體化提供方向。

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