大腸桿菌表達幾丁質酶對不同底物的酶學性質及其降解產物分析*

呂夢圓，石佳仙，夏祥，林建國，蔡俊，胡瑛

(湖北工業(yè)大學輕工學部生物工程學院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室/工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢，430068)

幾丁質(chitin)是自然界僅次于纖維素的第二大生物質資源［1］，每年生物合成量約為100多億噸［2］，其中蝦、蟹等甲殼類的甲殼富含1/4～1/3的幾丁質。殼聚糖是幾丁質的N-脫乙?；难苌铮彩亲匀唤缥ㄒ淮罅看嬖诘奶烊粔A性多糖［3］。幾丁質和殼聚糖是由β(1→4)連接的2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(GlcNAc)和2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(GlcN)二元線性共聚物所組成的，脫乙酰化和乙?；g的平衡程度用脫乙酰度(DD)來表征。幾丁質由于分子內和分子間強烈的氫鍵作用而不溶于大多數(shù)溶劑，從而大大限制其應用。而甲殼寡糖溶解性增加，且具有提高免疫力，抑制癌腫細胞生長，促進肝脾抗體形成，促進鈣及礦物質的吸收，增加雙歧桿菌、乳酸菌等人體有益菌群，降血脂，降血壓，降血糖，調節(jié)膽固醇，減肥，預防成人疾病等功能，可用于醫(yī)藥、功能性食品等領域［4］。所以，酶法降解幾丁質來制備甲殼寡糖是幾丁質研究和開發(fā)利用的熱點之一。

幾丁質酶(Chitinase，Ec.3.2.1.14)是一類能特異性和選擇性催化降解幾丁質β-1，4-糖苷鍵的水解酶［5］。且?guī)锥≠|酶還具有多種潛在用途，如抗真菌，防治病蟲害，制備功能性甲殼寡糖，處理幾丁質廢物，制備真菌原生質體等［6-7］。幾丁質酶根據(jù)其氨基酸序列主要分為18、19和20三個家族［8-9］。18族水解主要采用雙替換構型保持機制，即底物的N-乙酰基團的鄰助作用和底物發(fā)生變形成船形構型協(xié)助催化。根據(jù)幾丁質酶切割底物的位點不同，又可分為β-N-乙酰氨基葡萄糖、外切酶和內切酶。幾丁質外切酶能從幾丁質的非還原端以二糖為單位進行切割，產物為甲殼二糖。N-乙酰氨基葡萄糖酶能把二糖酶切為單糖，也就是乙酰氨基葡萄糖。幾丁質內切酶可以隨意酶切幾丁質之間的糖苷鍵來得到甲殼寡糖［10］。產幾丁質酶的微生物種類很多，包括細菌、放線菌和真菌等。Vaaje-Kolstad從Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403中得到的幾丁質水解體系，含有幾丁質酶18族和幾丁質結合蛋白33族，可水解α-和β-幾丁質，但約85% α-幾丁質未被水解［11］。以4-甲基傘形酮人工合成的各種熒光底物由于反應靈敏而常常作為底物檢測酶活和研究酶學性質，但天然底物和熒光底物之間存在較大差異。天然幾丁質結晶度高而溶解性差，但水溶性殼聚糖可溶于水，DD和幾丁質較接近。幾丁質酶是一類差異較大的水解酶類，已有不同來源的幾丁質酶的分離純化及性質研究的報道［4-9］。

本文將來源于Lactococus lactis ssp.lactis IL1403菌株的幾丁質酶BL21(DE3)基因的重組質粒轉化到E.coli BL21 DE3中進行大量表達，純化后得到幾丁質酶，采用SDS-PAGE分析其分子量，采用還原糖法和熒光法來研究幾丁質酶對不同底物的酶學性質，研究了pH、溫度、不同金屬離子和表面活性劑對酶活的影響，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定米氏方程，并采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)對酶解產物進行分析比較，為幾丁質酶降解不同底物提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

考馬氏亮藍G-250、N-乙酰氨基葡萄糖和4MU-(GlcNAc)3購于 Sigma公司;系列幾丁寡糖(Glc-NAc)2、(GlcNAc)3、(GlcNAc)4、(GlcNAc)5和(Glc-NAc)6，青島博智匯力生物科技有限公司;幾丁質，上海源葉生物有限公司;低分子量標準蛋白，Takara公司產品;其余試劑均為國產分析純。E.coli BL21(DE3)，Invitrogen公司;Ni-NTA 柱(3 cm ×5 cm)，上海生工生物工程有限公司;TLC玻璃硅膠板，青島海洋化工;JY92-11超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;蛋白電泳儀，北京六一儀器;LS-45/55熒光分光光度計，美國Perkin Elme公司;LC-20AD，日本SHIMADZU公司。

1.2 不同底物的制備

1.2.1 膠體幾丁質的制備

按照參考文獻［12］制備。

1.2.2 N-乙酰化殼聚糖的制備

按照文獻［13］進行N-乙?；磻捎盟釅A滴定法測定合成產物的脫乙酰度，水溶性殼聚糖的DD為50%左右;N-乙?；瘹ぞ厶堑腄D為70%左右。

1.3 克隆幾丁質酶基因的表達純化

重組質粒pETM11-LlChi18A由加拿大Alberta大學提供，并采用化學法轉化到表達載體E.coli BL21(DE3)中［11］。通過優(yōu)化產酶條件后，接種隔夜培養(yǎng)的E.coli到含有50 μg/mL卡那霉素的150 mL Luria-Bertani培養(yǎng)基，在37℃和250 r/min下培養(yǎng)至OD600達到 0.6 時，添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)最終濃度為0.05 mmol/L，在20℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，4℃離心10 min(8 000r/min)收集菌體，用PBS緩沖溶液(pH7.5)洗滌菌體。以10倍體積濃縮加入PBS，進行超聲波破碎。功率40 W，超聲4 s，間歇6 s，超聲時間15 min。破碎后的菌液于4℃離心10 min(10 000 r/min)，取上清液采用Ni-NTA進行親和層析純化。用流動相緩沖液平衡柱子，收集甲殼酶的峰的流出液，用10 kDa超濾膜去除收集液中的咪唑并濃縮酶液，得到純化后的幾丁質酶液。

1.4 蛋白質性質

1.4.1 SDS-PAGE

采用垂直板狀電泳，SDS-PAGE按標準方法進行［14］。

1.4.2 考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量［15］

以牛血清白蛋白(BSA)作為標準品測定其蛋白質濃度的標準曲線(Y=0.753 7X-0.038 12，R2=0.993;X為蛋白質濃度，Y為吸光度)。根據(jù)標準曲線和A595吸光度值換算幾丁質酶液的蛋白質含量。

1.5 幾丁質酶的酶學性質

1.5.1 酶的底物特異性

分別以膠體幾丁質、N-乙?；瘹ぞ厶?、水溶性殼聚糖和4MU-(GlcNAc)3為底物，比較幾丁質酶的底物特異性。

1.5.1.1 膠體幾丁質、N-乙?；瘹ぞ厶?、水溶性殼聚糖為底物

底物濃度分別為 0.1%，參照 Nawani法［16］，取一定量幾丁質酶(酶底比為0.3%)于50℃下水浴反應10 min，采用改良 Schales法［17］測定還原糖。1個酶活力單位是指在50℃下，每分鐘釋放1 μmol還原糖的酶量，而比酶活為1mg幾丁質酶所具有的酶活力單位［18］。3次平行的結果取平均值。

1.5.1.2 熒光底物

以熒光物質4-甲基傘形酮(4-MU)為標準物質，采用熒光分光光度計得到標準曲線Y=0.639 8X+2.448 4(R2=0.991;X 為4-MU 濃度，Y 為熒光值)。以不同濃度的4-MU-(GlcNAc)3(Sigma)為底物，反應液還包含2.0 nmol/L幾丁質酶，2.0 mg/mL牛血清白蛋白和200 μL 50 mmol/L檸檬酸-磷酸緩沖液。37℃下反應不同時間，取50 μL樣液，加入1.95 mL Na2CO3(0.2 mol/L)停止反應，采用熒光分光光度計(激發(fā)波長380 nm、發(fā)射波長460 nm)測定熒光強度，根據(jù)標準曲線計算酶活和比酶活，4次平行的結果取平均值。1個酶活力單位是指在37℃下，1 min釋放1 μmol熒光物質的酶量。比酶活為1 mg幾丁質酶所具有的酶活力單位。

1.5.2 動力學方程

將酶液與不同底物的膠體幾丁質和水溶性殼聚糖反應后測定其酶活力。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出該酶在不同底物下的Km及Vmax值［19］。

1.5.3 幾丁質酶對不同底物的酶學性質

分別以膠體幾丁質、水溶性殼聚糖為底物，研究幾丁質酶的最適反應pH范圍、最適反應溫度、不同金屬離子和不同表面活性劑對酶活力的影響。

1.5.3.1 反應pH對酶活的影響

將酶液分別加入不同pH值的緩沖溶液(檸檬酸-磷酸緩沖液 pH 3.0 ～4.0，HAc-NaAc緩沖液 pH 5.0 ～ 6.0，磷酸緩沖液 pH 7.0 ～ 8.0，Na2CO3-NaHCO3緩沖液 pH 9.0 ～10.0，硼砂-Na2CO3pH 11.0 ～12.0緩沖液)中，40℃下反應相同時間，測定幾丁質酶降解膠體幾丁質和水溶性殼聚糖的酶活，以酶活力最高者為100%。

1.5.3.2 反應溫度對酶活的影響

最適 pH 條件下，在不同溫度(30、40、50、60、70、80℃)下反應相同時間，分別測定幾丁質酶降解膠體幾丁質和水溶性殼聚糖的酶活，以酶活最高者為100%。

1.5.3.3 不同金屬離子對酶活的影響

在最適pH和溫度條件下，用50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液配置濃度為10 mmol/L的不同金屬離子(K+、Mg2+、Ca2+、Li+、Ba2+、Ni2+、Zn2+、Na+)緩沖液，采用幾丁質酶分別降解膠體幾丁質和水溶性殼聚糖，測定酶活，以不含金屬離子的反應液為100%。

1.5.3.2 不同表面活性劑對酶活的影響

用50mmol/L HAc-NaAc緩沖液配置不同濃度的表面活性劑(Trition-100、Tween-80和SDS)溶液，采用幾丁質酶分別降解膠體幾丁質和水溶性殼聚糖測定酶活，以不含表面活性劑的反應液為100%。

1.6 幾丁質酶降解產物的分析

1.6.1 TLC 分析

將10 mg/mL的不同底物及幾丁寡糖溶解于50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液(pH6.5)，取 0.2 mL 該溶液加30 μg幾丁質酶于40℃下酶解5 min(膠體幾丁質酶解1 h)，然后用玻璃硅膠板檢測酶解產物，展開劑的組成是 V(正丁醇)∶V(甲醇)∶V(氨水)∶V(水)=5∶4∶2∶1。待硅膠板自然風干后噴顯色劑(含0.5%二苯胺、0.5%苯胺的95%乙醇溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用)，于80℃下烘烤30 min，單糖和各寡糖呈現(xiàn)可見斑點［20］。

1.6.2 HPLC 分析

Prominence LC-20AD(島津，日本)，4.6 mm ×250 mm氨基液相色譜柱(依利特，中國)，流動相為V(乙腈)∶V(水)=7∶3，紫外檢測器(波長 195 nm)，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進樣10 μL。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE

用重組質粒pETM11-LiChi18A轉化大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌株，由該菌株所合成的幾丁質酶蛋白經超聲和Ni-NTA柱親和層析純化后在SDS-PAGE上呈現(xiàn)一條譜帶，純度較高，相對分子質量約為54 kDa(見圖1)。從圖1中還可以看出，重組大腸桿菌表達的幾丁質酶經細胞破碎后，存在于上清液中，還有一部分以包涵體的形式存在于沉淀中，但包涵體形式的幾丁質酶不具有酶活。通過前期優(yōu)化產酶條件，在IPTG濃度為0.05 mmol/L，20℃培養(yǎng)12 h，可使上清液中目的基因的量增加，而包涵體中的含量相對減少，但并不能完全消除包涵體的形成。

圖1 幾丁質酶Ni-NTA柱親和層析前后的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of chitinase before and after Ni-NTA column

2.2 幾丁質酶的酶學特性

2.2.1 酶的底物特異性

采用純化后的幾丁質酶分別降解膠體幾丁質、N-乙?；瘹ぞ厶?DD 30%)、水溶性殼聚糖(DD 50%)和4MU-(GlcNAc)3，結果如表1所示，說明該酶可以降解這些底物，特別是對水溶性殼聚糖(DD 50%)，雖然和熒光底物相比，其比酶活低很多，但明顯高于膠體幾丁質和N-酰化殼聚糖，說明幾丁質酶對水溶性殼聚糖降解能力較高。這和Masaru等的研究結果相一致，說明幾丁質酶能水解部分N-乙?；瘹ぞ厶?，隨著乙?；鹊脑黾?，酶反應速率增加，酶切位點相應增加［21］。而對 4MU-(GlcNAc)3的比酶活為1 060.18 U/mg，比其他反應底物的高很多，這可能是由于熒光底物溶解性好且靈敏度高的原因。

表1 幾丁質酶對不同底物的比酶活Table 1 Specific enzyme activity of chitinase indifferent substrates

2.2.2 動力學方程

如圖2所示，采用Lineweaver-Burk作圖法測定米氏常數(shù)，結果表明該酶對膠體幾丁質的Km和Vmax值分別為 2.913 mg/mL 和 2.836 μmol/(min·mg)(Y=1.027 2X+0.352 6，R2=0.998 8)，對于水溶性殼聚糖的 Km和 Vmax值分別為 4.04 mg/mL和222.2 μmol/(min·mg)(Y=0.018 2X+0.004 5，R2=0.990 4)。膠體幾丁質的Km值較小，說明該幾丁質酶與膠體幾丁質的親和力較高。但對水溶性殼聚糖，雖然Km值比膠體幾丁質大1.4倍，但其Vmax值大78倍，說明其與幾丁質酶的親和力較低一點，但其降解速率大大提高，這與其較高的酰化度而較好的水溶性相關。

圖2 甲殼素酶的動力學方程Fig.2 Kinetic equations of chitinase

2.2.3 反應pH值對酶活的影響

通過不同底物測定幾丁質酶在不同pH值的緩沖液體系中的酶活力，結果如圖3(A)，說明不同底物對幾丁質酶的最適pH不同。當反應底物為水溶性殼聚糖時，pH 5～8時，相對酶活力在80%以上，在pH 7左右時酶活力最高，且隨著pH的酸堿性增強酶活力逐漸下降。幾丁質酶在不同的氫離子濃度下的解離程度不同，其高級結構中S-S鍵、疏水鍵及氫鍵受到影響，從而影響幾丁質酶構象的變化而表現(xiàn)出不同的活性。微生物幾丁質酶一般在pH 3～11范圍內有不同程度的酶活，最適pH值大都在6～7［22］。當反應底物為膠體幾丁質時，pH 5左右時酶活力最高，在pH 8左右時，相對酶活力在60%以上，這可能是膠體表面電荷的一定程度地增加有利于膠體的分散，但隨著pH的酸堿性增強酶活力逐漸下降。

2.2.4 反應溫度對酶活的影響

圖3 不同pH(A)和不同溫度(B)對幾丁質酶降解水溶性殼聚糖(■)和膠體幾丁質(●)的影響(n=3)Fig.3 Effects of pH(A)and temperature(B)on chitinase with water-soluble chitosan(■)or colloidal chitin(●)(n=3)

通過不同的底物測定幾丁質酶在不同溫度下酶的活力，結果如圖3(B)所示。Vaaje-Kolstad等以4MU-(GlcNAc)3為底物研究該幾丁質酶的最適溫度為37℃，由于該酶來源于Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403，其最適生長溫度為30℃。當反應底物為水溶性殼聚糖時，反應溫度在30～80℃之間，酶活力均在60%以上，說明該幾丁質酶對溫度的變化不是很敏感，60℃為酶反應最佳溫度，可以認為該酶為耐熱性酶［11］。但同時溫度的變化對反應底物也會產生一定的影響，因此隨著底物的改變，酶的最適溫度也會發(fā)生改變。當反應底物為膠體幾丁質時，在30～50℃酶活力均在80%以上，40℃為酶反應最佳溫度，當反應溫度在60℃以上時酶活力逐漸下降，這可能是溫度的升高不利于膠體的分散。

2.2.5 金屬離子對酶活的影響

在反應體系中加入10 mmol/L的不同金屬離子，比較幾丁質酶對水溶性殼聚糖和膠體幾丁質的酶活的影響，如表2所示。一價金屬離子K+、Li+、Na+對幾丁質酶降解兩種底物的活性均有不同程度的抑制作用(Li+＞K+＞Na+)。而二價金屬離子 Ni2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對膠體幾丁質的降解有明顯的促進作用，但對水溶性殼聚糖的降解沒有促進作用，且Ni2+和Zn2+有一定的抑制作用。說明金屬離子對幾丁質酶降解不同底物的影響存在一定差異。

表2 不同金屬離子對不同底物的酶活影響(n=3)Table 2 Effect of different metal ions on chitinase with different substrates(n=3)

2.2.6 表面活性劑對酶活的影響

在以膠體幾丁質和水溶性殼聚糖為底物的反應體系中加入不同濃度的表面活性劑，測定幾丁質酶活力，如表3所示。結果表明，0.5%Trition-100對幾丁質酶的酶活力影響不大，但增加Trition-100濃度到1%時，其對幾丁質酶活力有抑制作用。而Tween-80在其濃度為0.5%和1%時，對降解水溶性殼聚糖無明顯影響，但對降解膠體幾丁質有促進作用，這可能是Tween-80有利于膠體的分散。Tween-80對降解膠體幾丁質起一定的促進作用，而不同濃度的SDS有明顯的抑制酶活作用，特別是對膠體幾丁質。但對兩種底物都表現(xiàn)出隨著反應體系SDS濃度的增加，抑制作用顯著增加，這說明SDS可能破壞該幾丁質酶的高級結構。

表3 不同濃度表面活性劑對酶活影響(n=3)Table 3 Effect of surfactants on chitinase with different substrates(n=3)

2.3 幾丁質酶降解產物的分析

該幾丁質酶對各種幾丁寡糖和膠體幾丁質的酶解產物的TLC分析結果如圖4所示。結果表明，幾丁質酶能完全降解幾丁四糖和幾丁六糖(GlcNAc)6，其產物為幾丁二糖(GlcNAc)2;但不能完全降解幾丁三糖(GlcNAc)3和幾丁五糖(GlcNAc)5，其產物存在單糖(GlcNAc)和幾丁二糖(GlcNAc)2，而從圖中可以知道幾丁質酶不能降解幾丁二糖(GlcNAc)2，說明該幾丁質酶是內切幾丁質酶，以內切方式作用于甲殼聚糖主鏈內部的β-1，4糖苷鍵。幾丁質酶對膠體幾丁質的降解產物的TLC圖譜可以看出，其降解產物主要為幾丁二糖和乙酰氨基葡萄糖。而對水溶性殼聚糖因其脫乙酰度為50%，結構較復雜，降解圖譜較為復雜。所以，采用HPLC對幾丁質酶降解膠體幾丁質和水溶性殼聚糖的產物進行進一步分析，如圖5所示。膠體幾丁質酶解產物不僅存在幾丁二糖，而且存在乙酰氨基葡萄和氨基葡萄糖，因為天然幾丁質并不是完全乙?；?，而是乙酰氨基葡萄糖和小部分氨基葡萄糖的二元共聚物。水溶性殼聚糖的乙酰度更低，所以，其酶解產物主要有單糖和幾丁二糖，另外，還存在接近幾丁四糖的峰和較小的接近幾丁五糖和六糖的峰，應該是不同聚合度和不同結構單元的甲殼寡糖，說明該內切幾丁質酶水解時只需要糖苷鍵一側至少含有1個GlcNAc基團，即可作用于甲殼素和水溶性殼聚糖主鏈上(GlcNAc)-(GlcNAc)、(GlcNAc)-(GlcN)或者(GlcN)-(GlcNAc)的 β-1，4 糖苷鍵。

3 討論

本文以重組大腸桿菌大量表達并經過親和層析純化獲得幾丁質酶，比較其對不同底物的酶學性質。郝之奎等從Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1純化后的幾丁質酶分子量約為42 kDa;幾丁質酶的最適溫度為40℃;最適pH為6.5;幾丁質酶在45℃下比較穩(wěn)定，55℃以上穩(wěn)定性迅速下降;Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+(10 mmol/L)對丁質酶有不同程度的抑制作用，Na+、K+對幾丁質酶有激活作用;該幾丁質酶的Km 和 Vmax分別為22.96 mmol/L和9.066 U/mg［22］。張中等從粉棒束孢(Isaria farinosa)菌株中篩選出高產幾丁質酶菌株RCEF0622純化后的幾丁質酶分子量是38.5 kDa;該幾丁質酶對膠體幾丁質的Km為0.73 mg/mL;酶的最適反應溫度是40℃;最適反應 pH 值為 4.6;Mg2+，Mn2+，Al3+，K+，Ca2+，Ba2+等金屬離子對酶活力有明顯的激活作用，尤其是Mn2+對幾丁質酶的激活作用非常明顯;而Zn2+，Cu2+等對該酶有明顯的抑制作用;Cu2+對該酶活有較大程度的抑制作用［23］。Wang等篩選的菌株Pseudomonas sp.TKU015純化所得幾丁質酶對膠體幾丁質降解的最適pH值為5，pH值5～7時相對酶活力均在80%以上;最適溫度為50℃，70℃時基本失活;5 mmol/L Mg2+、Zn2+對酶活力有促進作用;0.5 mmol/L SDS可促進該酶活性，但2 mmol/L SDS抑制該酶活性［24］。而結果表明，經SDS-PAGE測得幾丁質酶LIChi18A分子量約為54 kDa，該幾丁質酶對不同底物的酶學性質存在差異。在參考文獻中大多是對膠體幾丁質為底物來討論幾丁質酶的酶學性質，而膠體幾丁質的降解費事且差異小，本實驗對水溶性殼聚糖和膠體幾丁質的最適pH和溫度以及金屬離子和表面活性劑的影響都分別進行了分析，兩者作為反應底物酶的最適條件存在較大差異。實驗證明該幾丁質酶對膠體幾丁質的最適溫度為40℃;最適pH為 5，Km 和 Vmax分別為 2.913 mg/mL 和 2.836 μmol/(min·mg)，穩(wěn)定性與張中等結果較為一致。對水溶性殼聚糖的最適溫度為60℃;最適pH為7，Km和Vmax值分別為 4.04 mg/mL 和 222.2 μmol/(min·mg)，降解作用較強，降解速率較快，溫度穩(wěn)定性較好。Ni2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對膠體幾丁質的降解有明顯的促進作用。但對水溶性殼聚糖的降解沒有促進作用，且Ni2+和Zn2+有一定的抑制作用。Tween-80對降解膠體幾丁質起一定的促進作用，而不同濃度SDS有抑制酶活作用，且濃度越高抑制作用越強。

此外，本文還對幾丁質酶對不同底物的降解產物進行分析，TLC和HPLC圖譜結果表明，通過不同底物的比較發(fā)現(xiàn)，該酶降解的主要產物為幾丁二糖。對膠體幾丁質的親和力較好，該酶降解膠體幾丁質的產物主要為幾丁二糖和單糖，而對水溶性殼聚糖的降解效果較好，Vmax值比膠體幾丁質增大78倍，比酶活約是膠體幾丁質的12倍，降解產物較為復雜，主要有單糖、幾丁二糖和甲殼寡糖，所以，通過該幾丁質酶降解水溶性殼聚糖可制備多種甲殼寡糖。甲殼低聚糖的溶解性和生理功能與其聚合度有密切關系，通過控制酰化度和水解反應過程來獲得高質量的不同聚合度的甲殼低聚糖，在醫(yī)藥、食品、化工和環(huán)保等諸多領域得到廣泛的應用或具有巨大的潛在應用價值。

圖4 (GlcNAc)n標樣(S)、(GlcNAc)n的降解產物(Cn)和膠體幾丁質的降解產物(C7)的TLC譜圖Fig.4 TLC spectra of(GlcNAc)n standards and different hydrolysates from(GlcNAc)n and colloidal chitin

圖5 (GlcNAc)1-6標樣(A)和膠體幾丁質(B)和水溶性殼聚糖(C)的酶解產物的HPLC譜圖Fig.5 HPLC spectra of(GlcNAc)1-6 standards(A)and different hydrolysates from colloidal chitin(B)and water-soluble chitosan(C)

致謝:感謝加拿大Alberta大學G?nzle教授提供含甲殼素酶基因的質粒。

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