電針對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠胃動(dòng)素及生長(zhǎng)抑素的影響

李秀紅,林國(guó)華,鄒卓成

(1.廣州市越秀區(qū)第二人民醫(yī)院,廣州 510180;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣州 510405)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病(DM)常見的一種慢性并發(fā)癥,主要的常見癥狀包括早飽、惡心、腹脹、嘔吐、打嗝、食欲不振、體重減輕等。目前,國(guó)內(nèi)外現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)DGP的病因及發(fā)展機(jī)理尚未完全闡明,治療上也無(wú)重大突破,而中醫(yī)藥在DGP治療上逐漸顯示其優(yōu)勢(shì)。本研究將對(duì)糖尿病胃輕癱的胃腸激素的作用機(jī)理進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究,在中醫(yī)學(xué)辨證論治理論指導(dǎo)下,結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì) DGP的發(fā)病機(jī)制和辨證分型的認(rèn)識(shí),探討有效的針灸療法的作用機(jī)理,明確電針療法對(duì)DGP的療效,以期更廣泛地應(yīng)用于臨床,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)健康 SD雄性大鼠 100只,體重為180～220 g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 DM模型制作[1]及分組

將100只SD大鼠先穩(wěn)定飼養(yǎng)3 d,均經(jīng)尿糖試紙檢測(cè)為尿糖陰性,剔除陽(yáng)性動(dòng)物。隨機(jī)分為對(duì)照組 30只和造模組70只。造模組給予禁食12 h后稱重,按大鼠總重量比稱取 STZ,放置在干燥滅菌瓶?jī)?nèi),外用錫紙包好,將檸檬酸緩沖液及裝有未溶解的 STZ的瓶子置冰浴(2～8℃),干燥避光保存。再將STZ用0.1 mmol/L的檸檬酸鈉緩沖液(pH值為4.5)配制成濃度為1%的溶液,按 55 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔一次性注射,確保 STZ在溶解后30 min內(nèi)注射完畢。注射后1、3、7 d分別測(cè)定大鼠非空腹尾靜脈血糖值,選用血糖濃度持續(xù)＞16.65 mmol/L。尿糖在3+～4+且能維持1星期以上者確定為DM模型建立。DM大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)10星期,所有大鼠均自由進(jìn)食。造模組使用STZ注射造成大鼠一部分胰島B細(xì)胞功能的破壞,外周組織對(duì)胰島素不敏感,同時(shí)喂以高脂(高糖)飼料,兩者結(jié)合便可誘導(dǎo)出病理、生理均接近人類2型DM的動(dòng)物模型。在造模成功的大鼠中分別隨機(jī)選取30只作為模型組和治療組。

1.3 治療方法

1.3.1 治療組

取足三里、中脘、胃俞穴,左右兩側(cè)輪換取穴,取穴方法參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》。將大鼠放入自制的大鼠固定器中,75%乙醇常規(guī)消毒后,采用0.25～0.40 mm×13 mm毫針進(jìn)行針刺,針刺深度為0.3～0.4寸,針刺后接上海泰成科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀,刺激波形選用15 Hz等幅波,強(qiáng)度以穴位皮膚輕微抖動(dòng)為度,留針15 min。治療后正常進(jìn)食。每日1次,5次為1個(gè)療程,療程間休息2 d,共治療3個(gè)療程。

1.3.2 模型組

在治療組接受治療時(shí),模型組大鼠也放入固定器中固定相同的時(shí)間。

1.3.3 對(duì)照組

不作任何處理。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)

1.4.1 一般狀況

每日觀察動(dòng)物的飲食情況、大小便、活動(dòng)狀況、皮毛光澤度及死亡情況,每星期測(cè)體重1次。

1.4.2 血糖檢測(cè)

所有大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d尾靜脈取血測(cè)非空腹血糖。

1.4.3 胃腸推進(jìn)率

末次電針后,各組大鼠禁食24 h,再經(jīng)口給予10%炭粉混懸液(其中活性炭和阿拉伯膠各占10%)按1 mL/100 g體重用量灌胃,30 min后用乙醚進(jìn)行麻醉,麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死,打開腹腔用鑷子輕輕提取上端至幽門、下端至回盲部的腸管,并置于托盤上,再將小腸拉成直線,用直尺測(cè)量胃腸推進(jìn)指標(biāo),胃腸推進(jìn)指標(biāo)通過(guò)以下公式計(jì)算得出,胃腸推進(jìn)率=(炭粉前端至幽門擴(kuò)約肌距離/幽門括約肌至小腸末端距離)×100%。

1.4.4 血清胃動(dòng)素(MOT)、生長(zhǎng)抑素(SS)的測(cè)定

各組大鼠麻醉后從眼睛取血 4 mL,置于無(wú)抗凝離心管(測(cè)血清MOT和 SS),全血標(biāo)本置于 4℃過(guò)夜后于1000×g離心20 min,取上清置于-20℃或-80℃保存,避免反復(fù)凍融。并送本校核醫(yī)學(xué)室用 ELISA法測(cè)定,所有標(biāo)本均在同一批中完成測(cè)定。試劑在使用前平衡至室溫。

1.4.5 胃竇組織MOT、SS的測(cè)定

剖腹取胃竇部新鮮組織各 1塊,置于﹣20℃冰箱保存?zhèn)溆脛驖{。將制備好的 10%勻漿用離心機(jī)3000 r/min左右離心10～15 min,取上清液置于-20℃或-80℃保存?zhèn)溆盟蜋z。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,多組資料間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間,對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為機(jī)警、活潑、反應(yīng)快、毛發(fā)光滑、皮毛致密、有光澤,生長(zhǎng)、進(jìn)食及二便均正常,實(shí)驗(yàn)期間無(wú)死亡。造模組大鼠造模后第3天開始出現(xiàn)進(jìn)食飲水量增加,尿量增多,隨后出現(xiàn)持續(xù)性多飲、多食(進(jìn)食飲水量為對(duì)照組的2～3倍),尿量增多,體重減輕;至第4星期時(shí)部分大鼠出現(xiàn)食量減少,大便性狀改變,稀便與干結(jié)便均可見到;第6星期時(shí)絕大部分大鼠除仍有多飲、多尿外,還可見到食量明顯減少、消瘦、精神倦怠、反應(yīng)遲鈍、皮毛疏松無(wú)光澤、腹部膨隆、大便干稀不等。造模組實(shí)驗(yàn)期間大鼠未治療前死亡9只(12.9%),具體死亡原因不明,估計(jì)跟最初造模成功后,血糖升高過(guò)快出現(xiàn)高血糖有關(guān);或飲水量不足,因?yàn)轲嚳氏嗷ラg互相廝殺等。治療期間未見死亡及丟失情況。

治療組治療1個(gè)療程(5 d)后,大部分大鼠癥狀逐步好轉(zhuǎn),開始出現(xiàn)食量增加,大便性狀得到不同程度的改善,皮毛逐漸恢復(fù)光澤,體重增加。

2.2 各組大鼠治療后一般情況比較

由表 1可見,治療組和模型組大鼠體重及胃腸推進(jìn)率與對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示DGP模型誘導(dǎo)成功。治療組治療后體重及胃腸推進(jìn)率與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示治療組能明顯改善DGP大鼠體重及胃腸推進(jìn)率。

表1 各組大鼠治療后一般情況比較 (±s)

表1 各組大鼠治療后一般情況比較 (±s)

注:與對(duì)照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 體重(g) 胃腸推進(jìn)率(%)治療組 30 361.07±31.401)2) 58.50±4.331)2)模型組 30 282.77±33.561) 45.43±6.111)對(duì)照組 30 518.67±38.97 69.60±3.73

2.3 各組大鼠血糖值變化比較

由表2可見,治療組和模型組大鼠造模后、治療10星期后及治療后血糖值與對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。治療組治療后血糖值與模型組比較,差異統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P＞0.05)。治療組治療后血糖值與同組治療10星期后比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 各組大鼠血糖變化比較 (±s,mmol/L)

表2 各組大鼠血糖變化比較 (±s,mmol/L)

注:與對(duì)照組比較1)P＜0.01;與同組治療10星期后比較2)P＜0.01

組別 n 造模后 治療10星期后 治療后治療組 30 28.17±1.161) 26.21±0.991) 22.56±1.041)2)模型組 30 28.21±0.961) 26.24±0.941) 26.17±1.101)對(duì)照組 30 5.74±0.63 5.52±0.62 5.65±0.57

2.4 各組大鼠血清及胃竇組織中MOT和SS含量比較

由表 3可見,治療組和模型組血清及胃竇組織中MOT和SS含量與對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。治療組治療后血清及胃竇組織中 MOT和SS含量與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 各組大鼠血清及胃竇組織中MOT和SS含量比較(±s,pg/mg)

表3 各組大鼠血清及胃竇組織中MOT和SS含量比較(±s,pg/mg)

注:與對(duì)照組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 部位 MOT SS治療組 30 血清 164.86±20.711)2) 107.59±8.271)2)胃竇組織 122.67±7.181)2) 58.90±11.491)2)模型組 30 血清 256.68±21.451) 73.59±6.481)胃竇組織 46.70±6.771) 66.99±10.291)對(duì)照組 30 血清 51.59±13.55 57.13±6.55胃竇組織 22.18±6.30 29.36±8.23

3 討論

3.1 關(guān)于STZ制作糖尿病大鼠模型的研制

大鼠腹腔內(nèi)或尾靜脈注射STZ導(dǎo)致糖尿病是通過(guò)STZ選擇性作用于大鼠胰腺,造成大鼠胰島B細(xì)胞不可逆損傷而不能產(chǎn)生胰島素,從而使血糖升高,是一種胰島素依賴型DM動(dòng)物模型[2]。本研究中,我們給造模組大鼠按55 mg/kg的劑量一次性腹腔注射配制好的STZ液。造模24 h后血糖≥16.65 mol/L,穩(wěn)定5 d即作為造模成功。結(jié)果顯示造模成功的大鼠實(shí)驗(yàn)期間血糖持續(xù)≥16.65 mol/L,尿糖陽(yáng)性(++～++++),并伴有典型的“三多一少”、體重增長(zhǎng)較慢,而對(duì)照組大鼠無(wú)“三多一少”表現(xiàn),體重上升較快。以上研究表明,本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的DM模型是成功的,STZ法可以通避選擇性破壞胰島細(xì)胞成功造成DM模型。胃腸功能障礙是DM常見并發(fā)癥。

3.2 本研究中DGP大鼠模型的確立

從實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn),在動(dòng)物模型的喂養(yǎng)過(guò)程中大約從DM形成的4星期左右開始,部分DM大鼠的進(jìn)食量開始下降,大便量與大便性狀出現(xiàn)異常,6星期后絕大部分DM大鼠除有多飲、多尿外,還可見到食量明顯減少、消瘦、精神倦怠、反應(yīng)遲鈍、皮毛疏松無(wú)光澤、腹部膨隆,大便干稀不等,并隨時(shí)間的延長(zhǎng)由輕到重,其異常逐漸顯著。本實(shí)驗(yàn)在DM模型建立約10星期后,采用炭粉推進(jìn)率反映大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能的指標(biāo),結(jié)果表明模型組的胃腸排空指數(shù)較低,與對(duì)照組相比較有顯著性差異(P＜0.01)。說(shuō)明DM確實(shí)存在胃腸運(yùn)動(dòng)功能減弱現(xiàn)象,提示DM大鼠胃排空延遲,存在糖尿病性胃輕癱。本實(shí)驗(yàn)所建立的大鼠DGP模型是成功的。

3.3 電針治療選穴原則

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)俞募合配穴法選用后三里、中脘、胃俞三個(gè)穴位進(jìn)行電針治療?！峨y經(jīng)本義》:“陰陽(yáng)經(jīng)絡(luò),氣相交貫,臟腑腹背,氣相通應(yīng)。”說(shuō)明臟腑之氣與俞募穴是相互貫通的?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》:“故善用針者,從陰引陽(yáng),從陽(yáng)引陰;陽(yáng)病治陰,陰病治陽(yáng)?！边x用胃的俞募穴胃俞及中脘相配,一陽(yáng)一陰,使陽(yáng)氣上升、濁陰下降,從而恢復(fù)中焦的升降功能。中脘、胃俞分別位于上腹部和背部,雖分別屬于任脈和膀胱經(jīng),但二穴分別是胃之募穴和背俞穴,是本腑之氣輸注或匯聚之處,故也可治療胃腑病。足三里為胃之下合穴,《靈樞·邪氣藏府病形》:“合治內(nèi)腑。”《素問(wèn)·咳論》:“治府者治其合?！毕潞涎ㄊ侵委熈“Y的主要穴位,而本病病位主要在胃,胃屬腑,取足三里有和胃通腑、降濁止嘔之功;《四總穴歌》:“肚腹三里留?！比∽闳镆越禋獬浿?與中脘和胃俞相配。故諸穴合用具有健脾和胃、健運(yùn)中州、通腑降濁的功效,能調(diào)節(jié)腸胃運(yùn)動(dòng),明顯減輕DGP各癥狀。吳湘等[3]發(fā)現(xiàn)針刺足三里后,糖尿病胃輕癱患者胃收縮頻率、胃竇收縮幅度及胃排空率明顯增加。同時(shí),胃腸的運(yùn)動(dòng)是由電生理控制的[4],電針也在一定程度上影響著其電生理活動(dòng)。

3.4 各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的討論

本實(shí)驗(yàn)采用炭粉推進(jìn)率反映大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能的指標(biāo),為目前常用反映胃腸運(yùn)動(dòng)功能的檢測(cè)指標(biāo)[5],主要用于了解固體食物排空情況。本研究中結(jié)果顯示,模型組胃腸推進(jìn)率與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說(shuō)明用STZ造模的DM大鼠確實(shí)存在胃腸運(yùn)動(dòng)功能減弱現(xiàn)象,提示本實(shí)驗(yàn)DGP模型誘導(dǎo)成功。治療組胃腸推進(jìn)率較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01),較模型組顯著增加(P＜0.01),提示電針有較強(qiáng)的促胃腸運(yùn)動(dòng)作用。

治療組治療后血糖值與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但與同組治療10星期后比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),提示電針不僅有較強(qiáng)的促胃腸動(dòng)力作用,還可能通過(guò)加速胃排空而調(diào)節(jié)DGP大鼠的血糖。其機(jī)理可能是電針促使胃腸蠕動(dòng)加快,食物均勻地排入小腸,餐后對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收較模型組及電針治療前提前。研究表明穴位刺激能在一定程度上降低糖尿病者血糖水平,而加速胃腸排空也能在一定程度上改善血糖水平。因此,尚不能確定本研究治療組治療后血糖濃度值較造模組及同組治療前實(shí)驗(yàn)觀察低是由穴位刺激直接降糖引起還是由加速胃排空引起的,或是兩者同時(shí)起作用的結(jié)果。

MOT屬于興奮胃腸運(yùn)動(dòng)的腦腸肽,是啟動(dòng)消化間期胃腸移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)的重要激素[6],靜脈注射MOT對(duì)正常人消化期的胃腸運(yùn)動(dòng)無(wú)明顯影響,但卻能明顯加速DGP患者餐后胃對(duì)液體和固體食物的排空。有研究[7-11]報(bào)道,SS可以抑制生長(zhǎng)激素、甲狀腺刺激激素、胰島素、胰高血糖素的分泌,可抑制胃蛋白酶、胃泌素的釋放,并且減少胰腺的內(nèi)外分泌以及胃小腸和膽囊的分泌,降低酶活性,對(duì)胰腺細(xì)胞有保護(hù)作用,可影響胃腸道吸收和營(yíng)養(yǎng)功能?？梢娤嚓P(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察糖尿病大鼠血清MOT和SS的含量,研究結(jié)果顯示模型組大鼠血中MOT水平顯著升高,與對(duì)照組有顯著性差異,模型組血清SS升高不明顯,而電針能明顯降低DM大鼠血中胃動(dòng)素水平以及提高SS水平。Kawagishi T等[13]發(fā)現(xiàn)伴神經(jīng)病變的DGP患者體內(nèi)MOT水平較對(duì)照組高,正常對(duì)照組胃排空同血漿MOT水平呈正相關(guān),即MOT水平高,胃排空也較快,但DGP患者卻成負(fù)相關(guān),即MOT水平比正常人高,而胃排空反而比正常人慢。另外,李麗霞等[14]在觀察電針對(duì)DGP大鼠MTL及胃泌素的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)DGP大鼠血漿中MOT顯著升高,電針治療后血漿MOT水平下降,說(shuō)明電針能改善DGP大鼠血中高M(jìn)OT狀態(tài),這與本研究結(jié)果相一致。DM患者血中胃動(dòng)素水平增高可能與其作用效能下降有關(guān),是一種代償性表現(xiàn)。SS可以抑制胃腸激素的分泌,電針降低糖尿病血中MOT可能與SS水平提高及加速胃排空功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中模型組血清及胃竇組織中SS均較對(duì)照組顯著升高,這與其他文獻(xiàn)研究[15]一致。在胃竇組織中,模型組MOT水平升高不明顯而SS升高,原因可能是當(dāng)DM大鼠血中MOT升高時(shí),外周組織的MOT水平則相對(duì)降低,并且可能與胃竇分泌的SS相對(duì)增高有關(guān)。而治療組中胃竇組織MOT水平升高及SS水平下降,這一結(jié)果與林國(guó)華等[16]的研究一致,說(shuō)明電針能顯著改善這一狀況,胃竇組織MOT升高,胃排空則加強(qiáng),故實(shí)驗(yàn)研究提示,電針可改善DGP大鼠的胃腸動(dòng)力障礙。此外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電針能夠升高DM大鼠血清SS水平和降低胃竇組織中的SS水平,但二者之間的相互變化關(guān)系尚不明確,亦未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道,故有待進(jìn)一步的研究。

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