酶標(biāo)抗原直接競爭ELISA方法檢測呋喃唑酮代謝物殘留

樊曉博,徐社會,蔣 寶,柴喜春

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗檢測研究中心,陜西渭南 714000;2.廣州瑞森生物科技有限公司,廣東廣州 511400)

酶標(biāo)抗原直接競爭ELISA方法檢測呋喃唑酮代謝物殘留

樊曉博1,徐社會2,蔣 寶1,柴喜春1

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗檢測研究中心,陜西渭南 714000;2.廣州瑞森生物科技有限公司,廣東廣州 511400)

采用酶標(biāo)抗原建立了高效、高靈敏的呋喃唑酮代謝物直接競爭的ELISA檢測方法。以呋喃唑酮單克隆抗體包被作為固相抗體,HRP標(biāo)記的抗原與標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)中呋喃唑酮的代謝物衍生物競爭結(jié)合抗體,建立了直接競爭酶聯(lián)免疫檢測體系。以3-氨基-2-惡唑烷酮的衍生物(CPAOZ)為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方法的IC50為0.08 μg/L,靈敏度為0.015 μg/L,線性范圍0.025～0.5 μg/L;檢測樣品的平均回收率為82.0%～121.0%,與其他結(jié)構(gòu)類似物基本無交叉反應(yīng)。建立呋喃唑酮酶標(biāo)抗原直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法,靈敏度高、特異性強、操作簡單,可以滿足畜禽水產(chǎn)實際樣品的檢測需要。

呋喃唑酮,3-氨基-2-惡唑烷酮,酶標(biāo)抗原,直接競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測

呋喃唑酮是人工合成的光譜抗菌藥,屬于硝基呋喃類藥物,因其具有抗病菌[1]、防止感染[2]等作用在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用,也作為預(yù)防畜禽和水產(chǎn)腸道疾病的飼料添加劑[3-6]使用,硝基呋喃類藥物殘留已引起民眾廣泛關(guān)注[7-8]。呋喃唑酮為致癌藥物,被動物服用后,硝基呋喃類藥物在食品中代謝產(chǎn)物會具有潛在的毒理性危害[9-10],普通的食品加工方法,如燒烤、微波加工、烹調(diào)等,均難以使其降解,對人類健康造成嚴(yán)重的威脅[11]。硝基呋喃類藥物在歐盟列為A類禁用藥物,規(guī)定在魚、蝦等水產(chǎn)品中不得檢出[12-15],我國農(nóng)業(yè)部 2002文件也要求在動物源食品中不得檢出硝基呋喃類藥物[16]。

目前硝基呋喃類藥物的檢測主要有儀器方法,如超高效液相色譜法(UHPLC)[17]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)[18-20]和酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)[21]等。儀器法比較準(zhǔn)確,但操作繁瑣,設(shè)備昂貴,難以滿足現(xiàn)場檢測的需要。酶聯(lián)免疫檢測方法基于抗原抗體具有高度特異性,操作簡單、準(zhǔn)確,檢測樣大,彌補儀器法的不足,非常適用于樣品快速篩查。目前,國外有報道建立高靈敏度的AOZ直接競爭ELISA方法[22-23],但國內(nèi)ELISA技術(shù)在檢測呋喃唑酮殘留方面的研究多采用間接競爭的方法,其檢測靈敏度普遍不如高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)[24]。本研究通過酶標(biāo)記抗原,固相包被抗體,建立了直接競爭AOZ-ELISA檢測方法,顯著提高了方法的穩(wěn)定性和靈敏度,通過對不同樣品的檢測,驗證了方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

呋喃唑酮代謝物(AOZ)、辣根過氧化物酶(HRP) Sigma公司;呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 百靈威化學(xué);CPAOZ-OVA(Ovalbumin)、抗CPAOZ單克隆抗體本實驗室自制;96孔微量反應(yīng)板 雷博公司;其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

G16-2恒溫培養(yǎng)箱 美國SHELL LAB;P200微量可調(diào)移液槍 吉爾森公司;Wellwash MK-2洗板機、MK-3酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Thermo公司;恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;1-13型快速離心機 Sigma公司;dc-12型水浴氮吹儀 上海安普科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CPAOZ標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 CPAOZ以甲醇配制成質(zhì)量濃度10 mg/L溶液,用PBS(0.01 mol/L,pH7.4))稀釋到500 μg/L作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。使用前配制成質(zhì)量濃度梯度為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/L的CPAOZ的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 CPAOZ-OVA酶標(biāo)記物的制備 參考文獻[25]溶解5 mg HRP于1 mL 0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5.6)中,加入新配置的0.1 mol/L過碘酸鈉0.5 mL,置4 ℃冰箱反應(yīng)30 min。反應(yīng)完后加0.5 mL 2.0%的乙二醇,4 ℃反應(yīng)30 min。向活化的酶溶液中加入0.5 mL 3 mg/mL CPAOZ-OVA(10%甲醇溶解)溶液混勻,于4 ℃先用蒸餾水透析2次,再換用0.01 mol/L PBS(pH7.4)透析2 d。透析完畢后取出,3000 r/min離心30 min,除去沉淀,上清液即為酶標(biāo)記物。

1.2.3 固相包被抗體制備 將CPAOZ單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH9.6)稀釋至0.1 mg/L,96孔微孔板中各加入200 μL,37 ℃放置過夜,棄去包被液,加入封閉液,每孔20 μL,封閉3 h。棄去封閉液,烘干,備用。

1.2.4 酶標(biāo)記物效價測定 取包被單克隆抗體的板條,將制備好的酶標(biāo)記物從1:100開始倍比稀釋,每孔加入100 μL,室溫反應(yīng)30 min,再加入100 μL底物溶液顯色,室溫避光20 min,終止后,酶標(biāo)儀以單波長450 nm測吸光值。以蒸餾水做空白對照。

1.2.5 反應(yīng)條件優(yōu)化 將CPAOZ單克隆抗體1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶6000 4種稀釋度包被,加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和100 mL稀釋度為1∶1000的酶標(biāo)記物,確定最佳包被稀釋度。用最佳包被稀釋度包板,加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量濃度為0.1、0.4、0.8、1.6 mg/L的酶標(biāo)記物,確定最佳的酶標(biāo)記物濃度。

1.2.6 直接競爭AOZ-ELISA操作步驟 取包被好的板條,加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品(或處理好的樣品)到相應(yīng)的微孔中,加入分析緩沖液稀釋的酶標(biāo)記物100 μL,室溫避光反應(yīng)30 min,將微孔中的反應(yīng)液甩掉,再將清洗液加滿每一微孔后甩掉,重復(fù)洗3次。在每一微孔加入底物溶液100 μL后,在室溫下避光靜置20 min。每一微孔加入100 μL反應(yīng)終止液,酶標(biāo)儀以單波長450 nm判讀。

1.2.7 樣品處理

1.2.7.1 測物為組織(魚肉、蝦肉,雞肉) 衍生反應(yīng):取1 g均質(zhì)樣品于離心管中,加入4 mL H2O和0.5 mL HCl及100 μL衍生試劑。振蕩混合1 min。置于37 ℃烘箱靜置過夜(約16 h)。

萃取流程:加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4,0.4 mL NaOH,5 mL乙酸乙酯。振蕩混合約1 min。離心10 min(3000 r/min)。取2 mL上層溶液(乙酸乙酯層)至10 mL玻璃瓶中。于50 ℃下,利用氮氣將乙酸乙酯層快速吹干。加入1 mL正己烷,先將殘余物完全溶解,再加入1.6 mL PBS,3000 r/min離心10 min。取下層溶液進行檢測。樣品稀釋倍數(shù)為4。

1.2.7.2 待測物為生乳 生乳需先離心10 min(3000 r/min),避開上層乳脂,取下層液1 mL置入離心管中,加入4 mL H2O和0.5 mL 1 mol/L HCl及100 μL衍生試劑,其余歩驟同組織。

1.2.7.3 待測物為蜂蜜 取1 mL蜂蜜樣品置入離心管中,加入1 mL H2O,0.5 mL 1 mol/L HCl,10 mL正己烷。振蕩混合約1 min,用離心機離心10 min(3000 r/min),置于-20 ℃冷凍60 min。移去上層液后,50 ℃水浴,將冷凍層融化。加入50 μL衍生試劑,振蕩混合約1 min。其他步驟同組織樣。

1.2.8 考核指標(biāo) 靈敏度:以10%抑制率的對應(yīng)濃度作為最低檢測限(LOD),抑制率20%～80%作為定量線性檢測范圍。

式(1)

式中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值,B0為0濃度的平均吸光度值。

特異性:將AOZ的結(jié)構(gòu)類似物呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因及其衍生物配成不同質(zhì)量濃度的溶液,采用ELISA方法檢測其IC50,計算交叉反應(yīng)率。

式(2)

回收率:向各種陰性樣品中分別添加不同質(zhì)量濃度的AOZ標(biāo)準(zhǔn)品,處理后用ELISA方法檢測,每個濃度作3個平行測定。

1.2.9 進口試劑盒檢測結(jié)果對比 與德國拜發(fā)ELISA試劑盒檢測相同的樣品,對結(jié)果進行比較。兩種試劑盒分別對相同的樣品進行檢測,計算拜發(fā)試劑盒檢測樣品的回收率,以拜發(fā)試劑盒檢測結(jié)果為參考計算試劑盒樣品檢測回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HRP-CPAOZ-OVA酶標(biāo)記物效價測定

由圖1可知,酶在標(biāo)記抗原的過程中,酶活損失較小,標(biāo)記后酶活力很高,酶標(biāo)記物效價都在1∶101200以上,可以滿足后期檢測的要求。

圖1 酶標(biāo)記物效價曲線(n=3)Fig.1 Titer determination curve of enzyme labled antigen(n=3)

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

抗原和抗體的質(zhì)量濃度對免疫檢測方法的靈敏度和特異性有重要的影響,因此有必要對抗體和抗原的濃度進行優(yōu)化。

2.2.1 最佳抗體稀釋度的確定 以最高OD值(Amax)、IC50和Amax/IC50為綜合參考指標(biāo),由圖2可知,最高OD值與包被抗體濃度呈正比,抗體濃度過高時,抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合過多,方法的靈敏度下降。當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)2000時,與稀釋倍數(shù)4000時IC50比較接近,但稀釋4000倍表示靈敏度的Amax/IC50數(shù)值最大,靈敏度最高,其最高OD值也在適宜的范圍內(nèi),所以選擇包被抗體的稀釋度為4000。

圖2 包被抗體稀釋度曲線Fig.2 Dilution curve of antibody

2.2.2 最佳酶標(biāo)抗原濃度確定 選擇包被抗體稀釋度為1∶4000,選擇不同濃度的酶標(biāo)抗原做直接競爭ELISA實驗,結(jié)果如圖3所示。隨著酶標(biāo)抗原的濃度降低,最高OD值隨之下降,在酶標(biāo)抗原濃度為0.8 mg/L時,Amax值在適宜的范圍內(nèi),IC50值最小,Amax/IC50最大,此濃度下體系的靈敏度最高。故選擇此濃度為最佳的酶標(biāo)抗原濃度。

圖3 酶標(biāo)抗原濃度曲線Fig.3 Concentration curve of HRP-CPAOZ-OVA

2.3 AOZ-ELISA方法考核

2.3.1 方法靈敏度 在優(yōu)化條件下,以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/L)的對數(shù)值做橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示。

圖4 AOZ-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.4 Standard curve of AOZ-ELISA(n=3)

在一系列條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上方法LOD(IC10)為0.015 μg/L,IC50為0.08 μg/L,線性檢測范圍0.025～0.5 μg/L,R2=0.9902,線性關(guān)系良好。

2.3.2 方法特異性 將AOZ的結(jié)構(gòu)類似物及其衍生物配成不同質(zhì)量濃度的溶液作為被測物,采用ELISA方法測定其IC50。結(jié)果如表1所示,與呋喃妥因衍生物的交叉反應(yīng)率為0.5%,與其他結(jié)構(gòu)類似物基本沒有交叉反應(yīng),說明抗體對AOZ衍生物特異性很高。

表1 交叉反應(yīng)率的測定

2.3.3 方法準(zhǔn)確度 樣品加標(biāo)回收率是評價ELISA檢測方法準(zhǔn)確度的一個重要指標(biāo)。對樣品進行檢測時,由于抗體對AOZ基本不識別,所以需要對樣品進行衍生化處理,以對醛基苯甲酸作為衍生試劑使藥物轉(zhuǎn)化成衍生產(chǎn)物。添加回收實驗中,模擬實際樣品,向待測樣品中添加AOZ標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)方法的檢測限及稀釋倍數(shù)添加濃度為0.4、1.0和1.5 μg/kg,檢測樣品分別為魚肉、蝦肉、雞肉、生乳和蜂蜜。由表2可見,組織樣品和生乳樣品添加回收率在80%～120%之間,蜂蜜樣品添加回收率在82.0%～121.0%之間,符合檢測的要求,說明該方法重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,滿足實際樣品的檢測要求。

表3 兩種試劑盒檢測結(jié)果比較

表2 回收率實驗結(jié)果

2.3.4 檢測結(jié)果對比 采用德國拜發(fā)呋喃唑酮試劑盒檢測相同的樣品,與本研究建立的ELISA方法比較,確定其回收率,檢測方法的可信度。以拜發(fā)ELISA試劑盒的檢測結(jié)果為依據(jù)計算回收率,結(jié)果如表3所示,回收率在可接受的范圍內(nèi),兩種方法對相同樣品的測定值接近,建立直接競爭ELISA的方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

本研究利用辣根過氧化物酶成功標(biāo)記抗原,標(biāo)記后酶標(biāo)記物的效價可以滿足檢測要求,建立了直接競爭呋喃唑酮酶聯(lián)免疫分析方法。該方法包被抗原的稀釋倍數(shù)為4000,酶標(biāo)抗原的工作濃度為0.8 mg/L;在CPAOZ質(zhì)量濃度在0.025～0.5 μg/L時有較好的線性關(guān)系,檢測限為0.015 μg/L,IC50為0.08 μg/L,與其他結(jié)構(gòu)類似物不存在交叉反應(yīng),實際樣品檢測平均回收率在82.0%～121.0%之間。相比現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫檢測方法,本方法檢測速度快、靈敏度和穩(wěn)定性有了明顯的提高,與進口試劑盒進行比較,檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可以滿足現(xiàn)有的檢測需要,具有良好的應(yīng)用前景。

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Direct competitive ELISA with HRP labeled antigen for determination of furazolidone metabolite residues

FAN Xiao-bo1,XU She-hui2,JIANG Bao1,CHAI Xi-chun1

(1.Weinan Testing & Inspection and Research Center of Agricultural Products and Food,Weinan Vocational & Technical College,Weinan 714000,China;2.Guangzhou Ruisen Biotechnology Corporation,Guangzhou 511400,China)

In this study,a rapid and high sensitive direct competitive enzyme-linked immunoassay(dc-ELISA)method based on the antigen labeled by Horseradish Peroxidase(HRP)was established,which could be applied to the detection of 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ)that is a metabolite of furazolidone in real sample. In the direct competitive assay,monoclonal antibody was bound on the surface of a microtiter plate,then the standards(or the sample)competed with CPAOZ antigen for the antibody binding sites. Calibration curve was prepared for 3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]amino}-2-oxazolidinone(CPAOZ),the IC50of dcELISA was 0.08 μg/L,the limit of detection was 0.015 μg/L,detection range was 0.025～0.5 μg/L. The recoveries of all kinds of samples were range from 82.0% to 121.0%. There was almost no cross reaction with other drugs of similar construction. The conclusion suggested that the AOZ-ELISA was a great method with high sensitivity for detecting AOZin samples.

furazolidone;3-amino-2-oxazolidinone(AOZ);Horseradish Peroxidase(HRP)labeled antigen;direct competitive ELISA(dc-ELISA)

2015-02-12

樊曉博(1984-)，女，碩士研究生，講師，研究方向:食品快速檢測技術(shù),E-mail：shine2786@163.com。

渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年科研基金項目(WZYQ201405)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)21-0318-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.057