漚麻廢水處理池微生物多樣性分析及其Fosmid文庫酶活初步篩選

董 亮,俞勤麗,董志揚(yáng),王 麗,*,王遠(yuǎn)亮,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長沙 410128;2.中國科學(xué)院微生物研究所,微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101)

漚麻廢水處理池微生物多樣性分析及其Fosmid文庫酶活初步篩選

董 亮1,俞勤麗2,董志揚(yáng)2,王 麗2,*,王遠(yuǎn)亮1,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長沙 410128;2.中國科學(xué)院微生物研究所,微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101)

通過構(gòu)建元基因組16S rRNA文庫和Fosmid文庫,對富含纖維素、半纖維素等大分子有機(jī)物的湖南沅江明星麻廠堿性漚麻廢水處理池(pH9.35)微生物多樣性進(jìn)行了分析和新的工業(yè)用酶基因篩選,發(fā)現(xiàn)該堿性處理池原核微生物主要以細(xì)菌為主,包括厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠菌門等四個(gè)細(xì)菌類群,其中變形菌門彎曲桿菌科硫磺單胞菌屬細(xì)菌和腐敗希瓦氏菌為優(yōu)勢菌群,其次為擬桿菌門和厚壁菌門。該環(huán)境古菌的生物量和豐度較少,以廣古菌門馬氏甲烷八疊球菌為優(yōu)勢類群。并且從該堿性池元基因組Fosmid文庫中篩選出包括淀粉酶(36個(gè))、脂肪酶(9個(gè))、蛋白酶(4個(gè))、纖維素酶(4個(gè))在內(nèi)的一系列食品和工業(yè)用酶活性克隆。為進(jìn)一步開發(fā)和利用該堿性處理池微生物基因資源奠定了基礎(chǔ)。

漚麻廢水處理,原核微生物多樣性,16S rRNA文庫,堿性酶

極端微生物是最適合生活在極端環(huán)境中的微生物的總稱,包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜壓、嗜金、抗輻射和極端厭氧等多種類型。嗜堿微生物是指那些最適生長pH為8.0以上,通常在pH9～10之間生長的微生物[1]。嗜堿微生物在許多自然和人工環(huán)境中都存在,天然環(huán)境如天然堿湖、堿性沙漠等,人工環(huán)境如水泥制造、印染、造紙、食品加工等工業(yè)過程排出的堿性廢水和堿性廢渣等。嗜堿細(xì)菌可以產(chǎn)生堿性胞外酶,具有高pH下穩(wěn)定的特點(diǎn),如堿性纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶等,可用于洗滌劑添加劑、紡織、造紙、制革工業(yè)等。

亞麻是一種重要的韌皮纖維作物,其纖維具有耐用、衛(wèi)生和附加值高等特點(diǎn),是一種環(huán)保型的纖維原料,可加工成各種高檔服裝、裝飾用品和軍用、航空、消防、漁業(yè)、醫(yī)療等產(chǎn)業(yè)用布。亞麻纖維存在于亞麻原莖的韌皮部,為了制取亞麻中的可紡纖維,必須破壞纖維束與周圍組織的連接程度,使得韌皮部與木質(zhì)部易于分離,同時(shí)又較少破壞連接單纖維之間的膠質(zhì),這個(gè)過程被稱為亞麻原莖脫膠。生物脫膠是目前采用的最廣泛的方法,原料經(jīng)過溫水漚制[2-5],通過果膠分解微生物[6],把木質(zhì)素和纖維素進(jìn)行分離,同時(shí)麻莖中的各種有機(jī)物也擴(kuò)散到水中,脫膠分離過程中產(chǎn)生高濃度有機(jī)廢水。廢水的處理往往采用厭氧生物處理法,污水中的有機(jī)物經(jīng)多種微生物的共同作用,被最終轉(zhuǎn)化為甲烷、二氧化碳、硫化氫和氨。在漚麻廢水厭氧處理的過程中產(chǎn)酸是主導(dǎo)的反應(yīng),需要投加碳酸鹽來控制酸堿度。從而會導(dǎo)致漚麻廢水厭氧處理池進(jìn)口的pH較高。

湖南沅江明星麻廠是具有幾十年漚麻歷史的企業(yè),本研究自該企業(yè)漚麻廢水處理池中采樣,采集到pH9.35的堿性厭氧污泥,從中提取微生物總DNA,構(gòu)建了16S rRNA基因組文庫和元基因組Fosmid文庫,分析了其中細(xì)菌和古菌多樣性,并從元基因組Fosmid文庫中篩選到纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)酶活性克隆。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2012年4月,樣品采自湖南沅江明星麻廠漚麻廢水處理池。樣品pH為9.35。采集堿性厭氧漚麻廢水處理池下層泥水混合物樣品,置于無菌離心管,密封,運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后-80 ℃保存。

土壤DNA提取試劑盒 MO BIO公司的UltraCleanTMMega Soil DNA Isolation Kit;Taq 酶、DNA純化試劑盒 TIANGEN公司;T4連接酶 Promega公司;大腸桿菌EscherichiacoliDH5a 感受態(tài)細(xì)胞 北京全式金公司;酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

元基因組文庫活性篩選培養(yǎng)基:基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中加入相應(yīng)底物:0.2%可溶性淀粉(淀粉酶篩選培養(yǎng)基);1.6%脫脂奶粉(蛋白酶篩選培養(yǎng)基);1%三丁酸甘油酯(脂肪酶篩選培養(yǎng)基);0.2% CMC-Na(纖維素酶篩選培養(yǎng)基);0.5%木聚糖(木聚糖酶篩選培養(yǎng)基);0.2%果膠(果膠酶篩選培養(yǎng)基)。木聚糖酶篩選培養(yǎng)基、蛋白酶篩選培養(yǎng)基8磅壓力下20 min滅菌,其余培養(yǎng)基均15磅壓力下高壓蒸汽滅菌30 min。

元基因組文庫活性篩選試劑:盧格氏碘液:22 g KI,11 g I2,溶于500 mL水中,得到5倍的儲存液;DNS溶液:稱取酒石酸鉀鈉182.0 g,溶于500 mL蒸餾水中,加熱(不超過50 ℃),于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g,NaOH 21.0 g,苯酚5.0 g,無水亞硫酸鈉5.0 g,攪拌至溶解完全,冷卻后用蒸餾水定容至1000 mL,過濾后避光保存;剛果紅溶液:1 g剛果紅溶于1 L水中,得到0.1%的剛果紅染液。

1.2 樣品總DNA的提取以及16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增

1.2.1 樣品總DNA的提取 使用MO BIO公司的UltracleanTMMega Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取堿性池元基因組DNA。

1.2.2 微生物16S rRNA基因片段的特異性擴(kuò)增 細(xì)菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′;古菌通用引物A571F:5′-GCYTAAAGSRICCGTAGC-3′和UA1204R:5′-TTMGGGGCATRCIKACCT-3′(M=C/A,R=A/g,Y=C/T,S=G/C)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并經(jīng)DNA純化試劑盒純化。

1.3 16S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建

宋彬分析認(rèn)為，目前新三板企業(yè)IPO持續(xù)升溫?！靶氯迨袌隽鲃有圆?、估值低的局面未改變之前，掛牌企業(yè)轉(zhuǎn)由IPO登陸A股的趨勢將不會發(fā)生改變?！彪S著IPO的提速，新三板企業(yè)申請IPO的數(shù)量已出現(xiàn)了較大的增長，由于IPO審核標(biāo)準(zhǔn)趨嚴(yán)，新三板企業(yè)IPO通過率有所下降。

純化后的PCR產(chǎn)物連接pGEM-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐青霉素(50 mg/L)的IPTG/X-gal 平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取白斑菌落提取質(zhì)粒,利用質(zhì)粒酶切法進(jìn)行篩選,對陽性克隆的插入片段進(jìn)行測序。

1.4 基于16S rRNA基因片段的微生物多樣性分析

使用DECIPHER http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html分析并去除嵌合序列。將得到的有效序列用Sequence-Alingnment軟件進(jìn)行排序并獲得相似性矩陣,相似性≥97%的序列被認(rèn)為是相同的分類單元(OTU,operational taxonomic unit)并用其中一個(gè)序列作為代表[7],對每一個(gè)代表序列進(jìn)行BLAST(http://blast. ncbi. nlm. nih.gov/Blast. cgi)相似性比對[8],根據(jù)比對結(jié)果選取參照序列,用Clustal X 2.1進(jìn)行排序,Mega 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Jukes-Cantor參數(shù)模型計(jì)算進(jìn)化距離,鄰接法Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹)。

1.5 堿性池元基因組Fosmid質(zhì)粒文庫的構(gòu)建

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行文庫的構(gòu)建,采用DNA末端平滑化試劑盒對片段化的DNA片段進(jìn)行凝膠電泳分析,切膠回收5～10 kb的片段,連接到pCC1FOS載體上,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH10B中,涂布于含氯霉素的LB培養(yǎng)基平板,挑取克隆置于96孔板中,-20 ℃保存,用于后續(xù)文庫的篩選。

1.6 水解酶的篩選

使用Qfill3分裝含合適抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基于96孔板,每孔150 μL。將保存冰箱的文庫于4 ℃環(huán)境中解凍,使用全自動菌落復(fù)制點(diǎn)膜系統(tǒng)Qpix2將保存在384孔板的文庫轉(zhuǎn)移到96孔板,37 ℃、700 r/min過夜培養(yǎng)進(jìn)行活化。通過影印方法復(fù)制到篩選培養(yǎng)基中,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。然后按照下列方法進(jìn)行篩選:蛋白酶、脂肪酶篩選平板可以直接觀察透明圈,淀粉酶篩選平板需經(jīng)碘液染色后觀察透明圈;纖維素酶和果膠酶篩選平板需經(jīng)剛果紅染色,1 mol/L NaCl脫色后觀察透明圈;木聚糖酶陽性克隆篩選方法:在含0.5%木聚糖的液體LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),加入等體積的DNS溶液顯色,陽性克隆中的木聚糖酶可水解培養(yǎng)基中木聚糖為還原糖,與DNS反應(yīng)顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性處理池微生物元基因組DNA的提取與原核微生物16S rRNA基因擴(kuò)增

10000 r/min離心采集樣品,去除上清,剩泥土樣,可得到病毒,真細(xì)菌,古細(xì)菌等微生物。使用MO BIO公司的UltraClean? Mega Soil DNA Isolation Kit對堿性污泥樣品進(jìn)行DNA的直接提取。從每克泥樣中可提取約0.2～0.3 μg的DNA,電泳結(jié)果表明提取的DNA片段純度較高、大于10kb。將DNA樣品分別采用細(xì)菌和古菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如圖所示:細(xì)菌的擴(kuò)增產(chǎn)物為1500bp左右的單一目的條帶,古菌的擴(kuò)增產(chǎn)物為650bp左右的單一條帶,說明DNA樣品純度較好且PCR擴(kuò)增的特異性良好,滿足建庫要求。湖南沅江明星麻廠漚麻廢水處理池已閑置多年,其中的污泥有機(jī)質(zhì)含量較高且長期處于厭氧堿性環(huán)境下,已經(jīng)滋生出許多微生物。從基因組提取的結(jié)果來看,其中的生物量尚可,并且該土壤DNA提取試劑盒有效去除了其中的腐殖質(zhì)和其他污染物,得到的DNA可以不經(jīng)過后續(xù)的純化直接用于微生物16S rRNA擴(kuò)增。并且原位樣品較高的pH(pH9.35)并未影響該試劑盒對總DNA的提取效率。此外,以相同量的起始模板進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增后,得到的細(xì)菌PCR產(chǎn)物的濃度明顯比古菌PCR產(chǎn)物的濃度要高。表明該環(huán)境細(xì)菌的含量比古菌高。與許多堿性環(huán)境類似。

圖1 漚麻處理池污泥樣品總DNA電泳檢測Fig.1 Total DNA of yuanjiang Alkaline pool注:泳道1:DNA Marker;泳道2、3、4:湖南沅江麻廠漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥元基因組總DNA。

圖2 古菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA genes.注:泳道1:1kb DNA marker.;泳道2、3、4:湖南沅江麻廠漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥元基因組總DNA古菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;泳道5:陰性對照,以水為模板的古菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3 細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA genes注:泳道1:1kb DNA marker;泳道2、3、4:湖南沅江麻廠歐麻廢水處理池堿性厭氧污泥元基因組總DNA細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過連接轉(zhuǎn)化分別構(gòu)建細(xì)菌和古菌16S rRNA基因克隆文庫,從文庫中各隨機(jī)挑取96個(gè)陽性克隆測序并保存。得到細(xì)菌16S rRNA基因序列70條,古菌16S rRNA基因序列34條,將這104條序列運(yùn)用DECIPHER http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html程序進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其中14條為嵌合序列剔除,其余的90條用于后續(xù)分析。

2.3 基于16S rRNA基因序列的原核微生物多樣性分析

通過序列之間的相似性比對發(fā)現(xiàn),得到的63條細(xì)菌的序列可歸屬為13個(gè)不同的OTU,27條古菌序列可歸屬為4個(gè)不同的OTU。將代表13個(gè)細(xì)菌和4個(gè)古菌OTU的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLASTn相似性比對,結(jié)果見表1,表2。由表1可見,漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥的細(xì)菌優(yōu)勢克隆為BacA1(24條原始序列)和BacB1(11條原始序列)所代表微生物。其中與BacA1最相似的是耐堿硫磺單胞菌CampylobacteraceaebacteriumHTRB-L1(GQ863490),它們的相似性為98%;與BacB1最相似細(xì)菌為腐敗希瓦式菌ShewanellaputrefaciensCN-32 strain(NR_074817),相似性也為98%。表明沅江堿性池的優(yōu)勢細(xì)菌大多為已知微生物,只含有少量的未培養(yǎng)細(xì)菌。并且大多數(shù)細(xì)菌都是堿性或者厭氧環(huán)境來源的,如鹽堿湖、堿性污泥、地下水、油田等。古菌16S rRNA基因序列的相似性比對結(jié)果(表2)表明,該堿性處理池的優(yōu)勢克隆為產(chǎn)甲烷古菌,其中甲烷八疊球菌Methanosarcinamazei占據(jù)絕大部分(21條),另外還含有未培養(yǎng)古菌Methanomicrobiaarchaeon(AB742129)(1條)、甲烷螺菌屬古菌Methanospirillumhungatei(AB517987.1)(1條)。

表1 漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥細(xì)菌16S rRNA基因序列BLASTn相似性分析

表2 漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥古菌16S rRNA基因序列BLASTn相似性分析

圖4 基于16S rRNA基因序列的漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥古菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of archaea in Yuanjiang alkaline pool based on the 16S rRNA gene sequences

運(yùn)用Mega4軟件構(gòu)建的湖南沅江明星麻廠堿性漚麻廢水處理池原核微生物16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4和圖5。根據(jù)聚類樹分析該堿性池微生物的類群歸屬可見:該堿性池的細(xì)菌多樣性相對豐富,主要包括以下類群:變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)以及擬桿菌門(Bacteroidetes)的細(xì)菌以及廣古菌門(Euryarchaeota)的古菌。其中細(xì)菌的優(yōu)勢菌種BacA1和BacB1與Sulfuropirillumalkalitolerans和Shewanellaputrefaciens的相似性分別為98%和98%。

圖5 基于16S rRNA基因序列的漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of bacteria in Yuanjiang alkaline pool based on the 16S rRNA gene sequences.

2.4 堿性漚麻廢水處理池元基因組Fosmid文庫構(gòu)建

本研究成功構(gòu)建了該環(huán)境樣品的元基因組Fosmid文庫,平均插入片段20～30 ku,共包含19200個(gè)克隆。隨機(jī)挑取27個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定,如圖6所示。絕大部分都有插入片段。隨機(jī)挑取20個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子,送測序,獲得15條序列,序列分析結(jié)果表明,其中兩株與人腸道微生物相似性較高,兩株與瘤胃微生物相似性較高,一株與雞腸道微生物相似性較高,一株與海洋細(xì)菌相似性較高,一株與人腸道來源的未培養(yǎng)微生物相似,其余8株為新的序列,初步鑒定多樣性豐富,有利于后續(xù)功能基因的篩選。

2.5 Fosmid文庫中水解酶的篩選

對湖南沅江明星麻廠漚麻廢水處理池堿性厭氧污泥所構(gòu)建的元基因組Fosmid文庫進(jìn)行功能酶基因篩選。總計(jì)篩選了7680個(gè)轉(zhuǎn)化子,共篩選了6種酶基因,包括淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶和木聚糖酶。圖7中,1號為淀粉酶活性篩選平板,淀粉酶活性克隆子產(chǎn)生的淀粉酶降解了周圍的淀粉從而無法與碘液顯色而出現(xiàn)了明顯的透明圈;2號為纖維素酶活性篩選平板,纖維素酶活性克隆子產(chǎn)生的纖維素酶將周圍的羧甲基纖維素鈉分解產(chǎn)生單糖和低聚糖,0.1%剛果紅染色,經(jīng)過1 mol/L NaCl脫色后產(chǎn)生略帶黃色的透明圈;3號為脂肪酶活性篩選平板,脂肪酶活性克隆子產(chǎn)生的脂肪酸與羅丹明B反應(yīng)在紫外下發(fā)熒光;4號為木聚糖活性篩選培養(yǎng)基,在96孔板中每孔注入100 μL含0.5%的木聚糖,具有木聚糖酶活性的克隆子降解木聚糖產(chǎn)生還原糖,與等體積DNS在65 ℃條件下顯色1 h后顯色。初篩獲得99個(gè)淀粉酶陽性克隆,24個(gè)脂肪酶陽性克隆,7個(gè)蛋白酶陽性克隆,4個(gè)木聚糖酶陽性克隆,11個(gè)纖維素酶陽性克隆,3個(gè)果膠酶陽性克隆。經(jīng)過復(fù)篩,確定具有酶活性的陽性克隆包括:淀粉酶陽性克隆36個(gè),脂肪酶陽性克隆9個(gè),蛋白酶陽性克隆4個(gè),纖維素酶陽性克隆4個(gè)。

表3 漚麻廢水處理池元基因組Fosmid 文庫大分子有機(jī)物降解陽性轉(zhuǎn)化子

圖6 元基因組Fosmid文庫克隆酶切鑒定Fig.6 Restriction endonulease digestion of Fosmid library clones注:泳道1:λDNA HindⅢ酶切片段(23,9.6,6.6,2.3,2.0 kb);泳道2～27:元基因組Fosmid文庫轉(zhuǎn)化子Fosmid質(zhì)粒HindⅢ酶切片段(pCC1Fos大小為8139 bp)脈沖場凝膠電泳檢測。

圖7 漚麻廢水處理池元基因組Fosmid文庫大分子有機(jī)物水解陽性轉(zhuǎn)化子篩選Fig.7 Positive transformants with macromolecular organics hydrolysis activity screening in the Fosmid library of flax retting waste water microbes注:1.淀粉水解陽性轉(zhuǎn)化子復(fù)篩(0.2%可溶性淀粉);2.纖維素水解陽性轉(zhuǎn)化子復(fù)篩(0.2% CMC-Na);3.蛋白質(zhì)水解陽性轉(zhuǎn)化子復(fù)篩(1.6%脫脂奶粉);4.木聚糖水解陽性轉(zhuǎn)化子初篩(0.5%木聚糖)。

3 結(jié)論

該漚麻廢水處理池泥水混合物的pH達(dá)到了9.35,通過16S rRNA序列分析表明,其中包含變形菌門、厚壁菌門以及擬桿菌門的細(xì)菌以及廣古菌門的古菌。

其中細(xì)菌的優(yōu)勢菌種BacA1和BacB1與Sulfuropirillumalkalitolerans和Shewanellaputrefaciens的相似性均為98%。另一個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌BacB1與Shewanellaputrefaciens以及Shewanellahafniensis相似性均為98%。Sulfurospirillumalkalitolerans屬于ε-變形菌門彎曲桿菌科的細(xì)菌,為嚴(yán)格厭氧細(xì)菌,可以利用甲酸鹽、氫氣、乳酸鹽、丙酮酸鹽和延胡索酸鹽作為電子供體,硫代硫酸鹽、硫、硝酸鹽、亞硝酸鹽、砷酸鹽、延胡索酸鹽為電子受體。它本身是個(gè)耐堿菌,可以在pH7.1～9.7下生長,最適pH為8.5,鹽度范圍為0.6～1.5 mol/L Na+,最適為0.6 mol/L。在pH9下的最高生長溫度為41 ℃。在胞內(nèi)以硝酸鹽為電子受體的情況下可以氧化硫化物為硫元素[9]。另一個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌BacB1與Shewanellaputrefaciens[10]以及Shewanellahafniensis[11]相似性均為98%。這兩種細(xì)菌為兼性厭氧菌,耐冷產(chǎn)硫化氫細(xì)菌,在無氧的情況下能夠利用十種以上的電子受體包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、丙酮酸鹽、硫代硫酸鹽、硫元素、氧化三甲胺、四價(jià)錳以及三價(jià)鐵。希瓦氏菌屬的細(xì)菌在淡水、海水以及魚類都能分離得到。優(yōu)勢古菌甲烷八疊球菌Methanosarcinamazei[12]為厭氧產(chǎn)甲烷古菌?？梢岳肏2/CO2、醋酸鹽、甲醇、甲胺、三甲胺為碳源產(chǎn)生甲烷。在有機(jī)污染物厭氧發(fā)酵環(huán)境廣泛存在,是厭氧沼氣池中的重要功能菌群。而在pH9的環(huán)境中,該古菌的存在鮮有報(bào)道,是否在原位發(fā)揮功能需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

對堿性池Fosmid文庫進(jìn)行活性酶基因的篩選,總計(jì)篩選了7680個(gè)克隆子,共篩選了6種酶:淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶。并對其做了復(fù)篩,最后的復(fù)篩結(jié)果為:有淀粉酶活性的36個(gè)(強(qiáng)陽性4個(gè))、脂肪酶9個(gè)(強(qiáng)陽性2個(gè))、蛋白酶4個(gè)(強(qiáng)陽性1個(gè))、纖維素4個(gè)(強(qiáng)陽性1個(gè))。表明該環(huán)境大分子有機(jī)質(zhì)降解基因含量相對豐富,并且由于其獨(dú)特的堿性環(huán)境,篩選到的新酶可能同時(shí)具有嗜堿或耐堿的特性,為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供了良好的基因資源。目前正在對強(qiáng)陽性的克隆進(jìn)行測序、拼接和注釋,以期獲得這些新酶基因。對于具有優(yōu)良性質(zhì)的酶基因可以進(jìn)行后續(xù)的克隆表達(dá)以及酶學(xué)性質(zhì)的研究,以期作為食品添加劑、飼料和工業(yè)用酶制劑等。

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Microbial diversity analysis of alkaline flax retting wastewater and enzyme activity screen of Fosmid library clones

DONG Liang1,YU Qin-li2,DONG Zhi-yang2,WANG Li2,*,WANG Yuan-liang1,*

(1.Institute of Food Science and Technology,Hun an Agricultural University,Changsha 410128,China;2.State Kay Laboratory of Microbial Resources,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)

The microbial samples from alkaline sludge of retting waste water(pH9.35)which were riched in cellulose and hemicelluloses were collected. DNA was isolated and 16S rRNA genes were amplified. The bacterias in the alkaline anaerobic sludge contained 13 OTUs belong to Proteobacteria,Firmicute and Bacteriodetes. The most abundant bacterias wereSulfuropirillumalkalitoleransandShewanellahafniensis. The archaeas in the alkaline anaerobic sludge contained 3 OTUs belong to Euryarchaeota. The most abundant one wasMethanosarcinamazei. Fosmid library was constructed and macromolecular organics hydrolysis activities include cellulose,hemicelluloses,starch,protein and lipid hydrolyze activities were screened. After two runs of screening,36 clones contain amylase,4 clones with cellulose hydrolysis activity,4 clones contain proteinase and 9 clones contain lipase were obtained. It is very helpful to further exploit and use these gene resources and enzymes in food industry from this alkaline envioronment.

flax retting wastewater;prokaryotic microbial diversity;16S rRNA library;alkaline enzymes

2015-03-20

董亮(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與食品微生物學(xué)，E-mail：kunkunmumu2@163.com。

*通訊作者:王麗(1982-)，女，博士，助理研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：wangli07@im.ac.cn。 王遠(yuǎn)亮(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：yuanliangw@gmail.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(青年基金31300007)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0167-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.026