β-1,3-1,4葡聚糖酶在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá)

陳珊珊,吳珊珊,吳 斌,何冰芳

(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 211816)

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大腸桿菌中的高效分泌表達(dá)

陳珊珊,吳珊珊,吳 斌,何冰芳*

(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 211816)

在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表達(dá)。將實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的信號(hào)肽ff53與β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)進(jìn)行融合連接到pET-28a(+)上;通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,28 ℃、8 g/L乳糖誘導(dǎo)10 h,重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發(fā)酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達(dá)到1093 U/mL,與IPTG誘導(dǎo)的重組菌E.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)相比,提高了0.87倍。本研究為高密度發(fā)酵制備該酶奠定了基礎(chǔ)。

信號(hào)肽ff53,β-1,3-1,4葡聚糖酶,分泌表達(dá),大腸桿菌

β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)(BGL)是一種重要的工業(yè)用酶,主要來源于植物和微生物,能夠高效、專一分解禾本植物胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖,因而廣泛應(yīng)用于啤酒釀造業(yè)和飼料業(yè)[1-2]。在啤酒釀造過程中,β-1,3-1,4-葡聚糖酶能有效提高糖化得率[3],可降低麥汁粘度,改善啤酒風(fēng)味,保持成品酒穩(wěn)定性[4]。在飼料中添加這類酶可顯著降低谷物中所含β-葡聚糖的聚合度,改善谷物營養(yǎng)價(jià)值,增加飼料利用率[5-6]。除此之外,β-1,3-1,4-葡聚糖酶可以降解真菌的細(xì)胞壁,顯示抗真菌和植物病原菌的活性[7-8]。目前國內(nèi)外己克隆和表達(dá)了多種不同來源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,包括枯草芽孢桿菌[9-10]、地衣芽孢桿菌[11]、熱纖維桿菌[12]和牛鏈球菌[13]等。目前β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌中多為胞內(nèi)表達(dá),胞內(nèi)表達(dá)較好的酶活為1286 U/mL[11]。僅有少量研究實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá),Mao[14]等通過將β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆至pET-32a(+)中,在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá),胞外酶活為102.7 U/mL。作為釀造與飼料用酶,胞外表達(dá)可以極大簡化下游復(fù)性及分離純化,同時(shí)可減少表達(dá)蛋白對(duì)宿主菌的毒性和代謝負(fù)擔(dān),顯著提高表達(dá)量。

本課題組前期從B.subtilisLC-9 中得到一種高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌BL21(DE3)中的胞內(nèi)表達(dá)[15]。為了進(jìn)一步擴(kuò)寬β-1,3-1,4-葡聚糖酶的實(shí)際應(yīng)用,簡化其后續(xù)分離制備工藝,本研究將實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的信號(hào)肽ff53[16]與β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽基因(bgl)融合,在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表達(dá),為高密度發(fā)酵制備β-1,3-1,4-葡聚糖酶奠定了基礎(chǔ)。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列

注:下劃線為NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 枯草芽孢桿菌BacillussubtilisLC-9(CCTCCM208073)、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21/pET-bgl和表達(dá)載體pET-28a(+)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L):氯化鈉10,蛋白胨10,酵母粉5。固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂?？剐耘囵B(yǎng)基加入卡那霉素(50 μg/mL)。

1.1.3 酶和試劑 DNA限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 寶生物工程(大連)有限公司;2×Taq PCR Master Mix和Pfu DNA Polymerase 北京莊盟國際生物基因科技有限公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素 Sigma公司;乳糖 西隴化工股份有限公司;1-3,1-4-beta-D-Glucan和大麥β-葡聚糖 Megazyme公司;引物合成及測序 蘇州金唯智公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀 美國BIO-TECH;PCR儀 德國Eppendorf;凝膠成像系統(tǒng) 英國UVItec Cambrige;垂直電泳儀 美國Biorad;超凈臺(tái)工作室 蘇州凈化設(shè)備廠;紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆表達(dá) 參照文獻(xiàn)[15]的方法。

1.2.2 信號(hào)肽ff53融合β-1,3-1,4-葡聚糖酶的克隆表達(dá)。

1.2.2.1 表達(dá)引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)信號(hào)肽ff53和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽基因序列,設(shè)計(jì)over-lap擴(kuò)增策略的部分重疊引物,引物序列如表1所示。

1.2.2.2 Over-lap PCR 第一輪PCR:以ff53-F和ff53-bgl-Rm為引物擴(kuò)增上游信號(hào)肽ff53;以ff53-bgl-Fm和bgl-R擴(kuò)增β-1,3-1,4-葡聚糖酶的成熟肽bgl;第二輪PCR:以第一輪產(chǎn)物ff53和bgl為模板進(jìn)行延伸,獲得融合基因片段;第三輪PCR:以ff53-F和bgl-R為引物,以融合基因片段為模板,進(jìn)行擴(kuò)增獲得融合基因ff53-bgl[17]。

1.2.2.3 重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl的構(gòu)建 pET-28a(+)是受強(qiáng)噬菌體T7轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制的高效表達(dá)載體。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切,同時(shí)以相同的限制性內(nèi)切酶酶切pET-28a(+)。將酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳,回收雙酶切的融合基因和載體,T4 DNA Ligase連接,16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中,涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板,37 ℃過夜培養(yǎng)后。菌落PCR鑒定陽性重組子,挑選陽性重組子提取質(zhì)粒用NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證同時(shí)進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.3.1 IPTG誘導(dǎo) 將重組菌接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,180 r/min培養(yǎng)過夜后,按2%接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中(50 μg/mL卡那霉素),37 ℃,180 r/min培養(yǎng)OD600為0.6～0.9時(shí),參照文獻(xiàn)[11]的方法,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h。

取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于1.5 mL離心管,12000 r/min離心1 min。收集上清,另外用1 mL ddH2O重懸菌體,12000 r/min離心1 min,徹底除去上清,再用1 mL ddH2O重懸菌體。菌體于冰浴中超聲破碎至澄清,12000 r/min離心1 min,收集上清。

1.2.3.2 乳糖誘導(dǎo) 按方法1.2.3.1所述,分別加入終濃度為0.5、2、4、6、8、10 g/L的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo),28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳 取方法1.2.3中的發(fā)酵液上清和細(xì)胞破碎上清進(jìn)行分析。采用12.5%的分離膠和4%的濃縮膠的SDS-PAGE,發(fā)酵液上清和細(xì)胞破碎上清加入4×上樣緩沖液,沸水浴5 min后上樣15 μL,電泳后使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色[18]。

1.2.5 糖苷酶活力測定 采用二硝基水楊酸(DNS)法測定糖苷酶活力[19]:以1%(W/V)1-3,1-4-beta-D-Glucan 1 mL作為底物,加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液,45 ℃反應(yīng)10 min后,立即加入3.0 mL DNS溶液終止反應(yīng),沸水浴5 min顯色,冷卻后測540 nm下反應(yīng)液的吸光值,以滅活的酶液作為空白對(duì)照。酶活力單位(U)定義:每分鐘由底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位。

1.2.6 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì) 參照文獻(xiàn)[4]的方法,考察pH和溫度對(duì)胞外分泌的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的影響,研究該酶的溫度和pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號(hào)肽ff53與bgl基因的融合

為了實(shí)現(xiàn)信號(hào)肽ff53與bgl基因的融合,按方法1.2.2所述進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳(圖1a),上游序列ff53在150 bp左右有一條帶,下游序列bgl在650 bp左右有一條帶,與預(yù)計(jì)大小(上游159 bp,下游642 bp)一致。重疊后的PCR產(chǎn)物在800 bp左右出現(xiàn)一條條帶,與預(yù)計(jì)融合基因ff53-bgl條帶大小(801bp)基本符合(圖1b),這表明成功實(shí)現(xiàn)了信號(hào)肽ff53與bgl基因的融合。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product注:a:M:DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:ff53;2:bgl;b:M:DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:融合基因ff53-bgl

2.2 重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物ff53-bgl和pET-28a(+)分別經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切,經(jīng)T4 DNA Ligase連接獲得重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl,其構(gòu)建過程如圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl構(gòu)建圖Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET-ff53-bgl

對(duì)重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證,瓊脂糖凝膠電泳在約800 bp和5000 bp處出現(xiàn)條帶(圖3),與目的基因和pET-28a(+)的片段大小一致。測序結(jié)果表明克隆的序列與理論序列一致,表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl。同時(shí)構(gòu)建了不帶信號(hào)肽的重組質(zhì)粒pET-bgl作為對(duì)照。

圖3 重組質(zhì)粒pET-ff53-bgl經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證圖Fig.3 Idenfication of recombinant plasmid pET-ff53-bgl double digested by NcoⅠand XhoⅠ注:1:DL15000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2:DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);3:ff53-bgl/NcoⅠ-XhoⅠ;4:pET-ff53-bgl/NcoⅠ-XhoⅠ;5:pET-28a(+)/NcoⅠ-XhoⅠ。

2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3.1 重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl的分泌表達(dá) 按方法1.2.3.1所述進(jìn)行誘導(dǎo),以酶活力及SDS-PAGE電泳考察胞外分泌表達(dá)情況,結(jié)果如圖4,重組菌E.coliBL21/pET-bgl誘導(dǎo)表達(dá)10 h后的發(fā)酵液上清幾乎無酶活,重組細(xì)胞的破碎上清酶活力達(dá)到583 U/mL(見第3泳道),經(jīng)SDS-PAGE電泳在28 ku左右有一條明顯的蛋白條帶,這與β-1,3-1,4-葡聚糖酶理論分子量28 ku一致。重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發(fā)酵液上清酶活達(dá)到562 U/mL(見第4泳道),在28 ku左右出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,與不帶信號(hào)肽的β-1,3-1,4-葡聚糖酶大小一致,表明信號(hào)肽ff53已被切除。重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl總酶活(菌體OD 1.9)達(dá)到860 U/mL,總酶活是未加信號(hào)肽ff53的重組菌E.coliBL21/pET-bgl(菌體OD 2.1)的1.48倍。酶活力測定和SDS-PAGE結(jié)果顯示融合信號(hào)肽ff53的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌中不僅實(shí)現(xiàn)了高效的分泌表達(dá),還增加了總酶活力。

圖4 IPTG誘導(dǎo)重組菌的SDS-PAGE(a)及酶活力圖(b)Fig.4 SDS-PAGE(a)and enzyme activity(b) of recombined strain induced by IPTG注:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);泳道1:對(duì)照E.coli BL21/pET-28a(+);泳道2:E.coli BL21/pET-bgl發(fā)酵液上清;泳道3:E.coli BL21/pET-bgl細(xì)胞破碎上清;泳道4:E.coli BL21/pET-ff53-bgl發(fā)酵液上清;泳道5:E.coli BL21/pET-ff53-bgl細(xì)胞破碎上清。

2.3.2 重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl分泌表達(dá)的優(yōu)化 乳糖除了能作為lac操縱子的誘導(dǎo)劑外,本身也是一種碳源可以被菌體代謝利用,通過提高菌體量從而產(chǎn)生更多的目標(biāo)蛋白。按方法1.2.3.2所述用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo),結(jié)果如圖5,在一定范圍內(nèi),乳糖終濃度愈高,目的蛋白的表達(dá)量也愈高。當(dāng)乳糖終濃度為8 g/L時(shí),重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發(fā)酵液上清酶活達(dá)到最高,為1093 U/mL,與用IPTG誘導(dǎo)的重組菌相比,發(fā)酵液上清酶活力提高了0.87倍。此后隨著乳糖濃度的增加,目的蛋白的表達(dá)量不再增加并且略有下降。用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑,不僅可以節(jié)約生產(chǎn)成本,而且還提高了重組菌發(fā)酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力。

圖5 乳糖誘導(dǎo)重組菌SDS-PAGE(a)及酶活圖(b)Fig.5 SDS-PAGE(a)and enzyme activity(b) of recombined strain induced by lactose注:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);泳道1-6:E.coli BL21/pET-ff53-bgl分別在乳糖終濃度為0.5、2、4、6、8、10 g/L條件下誘導(dǎo)時(shí)的發(fā)酵液上清。

2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

胞外分泌的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶最適反應(yīng)pH和溫度分別為6.5和45 ℃,且在pH6.5 和45 ℃下穩(wěn)定;該性質(zhì)與野生菌BacillussubtilisLC-9產(chǎn)生的原始酶一致[4]。

3 結(jié)論

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作為一種重要的工業(yè)用酶,其應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展到飼料工業(yè)、釀酒工業(yè)、醫(yī)藥紡織等各個(gè)領(lǐng)域中,具有廣闊的應(yīng)用前景[20]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌中多為胞內(nèi)表達(dá),僅有少量研究實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。本研究采用over-lap PCR將本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)的信號(hào)肽ff53與β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)進(jìn)行融合,成功實(shí)現(xiàn)了β-1,3-1,4-葡聚糖酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效分泌表達(dá)。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,28 ℃、8 g/L乳糖條件下誘導(dǎo)10 h,重組菌E.coliBL21/pET-ff53-bgl發(fā)酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力達(dá)到1093 U/mL,與IPTG誘導(dǎo)的重組菌E.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)相比,提高了0.87倍;并且發(fā)酵液上清中目的蛋白占總蛋白的80%以上,有利于目的蛋白的分離純化。胞外分泌的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶最適反應(yīng)pH和溫度分別為6.5和45 ℃,且在pH6.5和45 ℃下穩(wěn)定。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大腸桿菌胞外高效分泌為進(jìn)一步高密度發(fā)酵制備該酶奠定了基礎(chǔ)。

[1]Flint H J,Mcpherson C A,Bisset J. Molecular cloning of genes from Ruminococcus flavefaciens encoding xylanase and beta(1-3,1-4)glucanase activities[J]. Applied and Environmental Microbiology,1989,55(5):1230-1233.

[2]Planas A. Bacterial 1,3-1,4-β-glucanases:structure,function and protein engineering[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology,2000,1543(2):361-382.

[3]Luo H Y,Yang J,Ying P L,et al. Gene cloning and expression of a new acidic family 7 endo-β-1,3-1,4-glucanase from the acidophilic fungusBisporasp. MEY-1[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2010,85(4):1015-1023.

[4]劉娟娟,吳斌,何冰芳. Bacillus subtilis LC-9 產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)與催化特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(27):13243-13246.

[5]Gohl B,Alden S. Elwinger K,et al. Influence of β-glucanase on feeding value of barley for poultry and moisture content of excreta[J]. British Poultry Science,1978,19(1):41-47.

[6]Mathlouthi N,Ballet N,Larbier M. Influence of beta-glucanase supplementation on growth performances and digestive organs weights of broiler chickens fed corn,wheat and barley-based diet[J]. International Journal of Poultry Science,2011,10(2):157-159.

[7]Hardoim P R,van Overbeek L S,van Elsas J D. Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth[J]. Trends in Microbiology,2008,16(10):463-471.

[8]金志雄,周圍,王婭,等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌swb8菌株β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌作用及細(xì)胞毒性[J]. 微生物學(xué)報(bào),2011,11:1527-1537.

[9]Olsen O,Borriss R,Simon O,et al. HybridBacillus(1-3,1-4)-β-glucanases:engineering thermostable enzymes by construction of hybrid genes[J]. Molecular and General Genetics MGG,1991,225(2):177-185.

[10]Masilamani R,Sharma O P,Muthuvel S K,et al. Cloning,expression of β-1,3-1,4 glucanase from Bacillus subtilis SU40and the effect of calcium ion on the stability of recombinant enzyme:invitroand in silico analysis[J].BIOINFORMATION,2013,9(19):958-962

[11]Teng D,Wang J H,Fan Y,et al. Cloning of β-1,3-1,4-glucanase gene fromBacilluslicheniformisEGW039(CGMCC 0635)and its expression inEscherichiacoliBL21(DE3)[J]. Applied microbiology and biotechnology,2006,72(4):705-712.

[12]Schimming S,Schwarz W H,Staudenbauer W L. Properties of a thermoactive β-1,3-1,4-glucanase(lichenase)fromClostridiumthermocellumexpressed inEscherichiacoli[J]. Biochemical and biophysical research communications,1991,177(1):447-452.

[13]Ekinci M S,Flint H J. Expression of Bifunctional Genes Encoding Xylanase and beta(1,3-1,4)-Glucanase in Gram-Positive Bacteria[J]. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences,2001,25(5):771-775.

[14]Mao S R,Lu Z X,Zhang C,et al. Purification,characterization,and heterologous expression of a thermostable β-1,3-1,4-glucanase fromBacillusaltitudinisYC-9[J]. Applied biochemistry and biotechnology,2013,169(3):960-975.

[15]劉娟娟.BacillussubtilisLC-9中β-1,3-1,4-葡聚糖酶的純化、酶學(xué)性質(zhì)研究及克隆表達(dá)[D].南京：南京工業(yè)大學(xué),2012.

[16]何冰芳,陳文華,米蘭,等.強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序及其應(yīng)用:中國,201310162455.9[P].2013-08-21.

[17]An Y F,Ji J F,Wu W F,et al. A rapid and efficient method for multiple-site mutagenesis with a modified overlap extension PCR[J]. Applied microbiology and biotechnology,2005,68(6):774-778.

[18]Christian R,Ronald K,Veronika J,et al. SDS-PAGE ofrecombinant and endogenous erythropoietins:benefits and limitations of the method for application in doping control[J]. Drug Testing and Analysis,2009,1(1):43-50.

[19]Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry,1959,31(3):426-428.

[20]陳龍軍,陳濟(jì)琛,陳亞蘭,等. β-1,3-1,4-葡聚糖酶在畢赤酵母中的克隆與表達(dá)[J]. 食品工業(yè)科技,2013,10:170-174.

Efficient secretory expression of β-1,3-1,4-glucanase inE.coli

CHEN Shan-shan,WU Shan-shan,WU Bin,HE Bing-fang*

(College of Pharmaceutical Sciences,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In this study,the highly secretory expression of β-1,3-1,4-glucanase was achieved inE.coli. Signal peptide ff53 developed by our team was fused with mature peptide gene(bgl)of β-1,3-1,4-glucanase,then cloned into the pET-28a(+)plasmid. Efficient extracellular expression was obtained under following optimized conditions:8g/L lactose at 28 ℃ for 10 h,resulting in the enzyme activity ofE.coliBL21/pET-ff53-bglin culture medium reached 1093 U/mL,which increased 0.87 folds compared with enzyme activity ofE.coliBL21/pET-bgl(583 U/mL)induced with IPTG. The study laid the foundation of high density fermentation of β-1,3-1,4-glucanase production.

signal peptide ff53;β-1,3-1,4-glucanase;secretory expression;E.coli

2015-03-10

陳珊珊(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué),E-mail:starrygirl@126.com。

*通訊作者:何冰芳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)、分子生物學(xué),E-mail:bingfanghe@njtech.edu.cn。

國家973計(jì)劃(2011CBA00807)；國家973計(jì)劃(2011CB707400)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0139-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.020