殼聚糖處理對兩種馬鈴薯干腐病菌的抑制效果比較

燕 璐,寇宗紅,畢 陽,朱 艷,李永才,王 毅

(甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

殼聚糖處理對兩種馬鈴薯干腐病菌的抑制效果比較

燕 璐,寇宗紅,畢 陽*,朱 艷*,李永才,王 毅

(甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

由鐮刀菌(Fusarium)引起的干腐病是馬鈴薯塊莖采后的重要病害。本文通過體外和體內實驗測定了不同濃度殼聚糖處理對馬鈴薯干腐病菌的抑制效果。結果表明,體外條件下殼聚糖處理能夠有效抑制F.sulphureum和F.sambucinum的孢子萌發(fā),不同濃度殼聚糖處理后F.sulphureum的孢子萌發(fā)相比對照下降了92%,F.sambucinum的孢子萌發(fā)幾乎完全被抑制。殼聚糖處理能夠有效抑制F.sulphureum和F.sambucinum的菌落直徑的擴展,其中以0.25%處理效果最好,比同期對照分別下降7.46%和8.9%,且對F.sambucinum的抑制效果較好。殼聚糖處理可顯著降低F.sulphureum和F.sambucinum損傷接種馬鈴薯塊莖切片的病斑直徑,0.25%的殼聚糖處理者的病斑直徑分別低于對照45.3%和34.5%,更高濃度處理并沒有增加抑制效果。由此表明,殼聚糖可通過直接抑菌抑制馬鈴薯的干腐病。

馬鈴薯,殼聚糖,干腐病

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是我國重要的經濟作物,其塊莖在貯藏期間頗易發(fā)生腐爛,不僅影響品質,而且造成較大的經濟損失[1]。由鐮刀菌(Fusarium)引起的干腐病是導致馬鈴薯塊莖腐爛最重要的真菌性病害[2],該病可占貯藏期間真菌性病害的50%以上[3-4],其中硫色鐮刀菌(F.sulphureum)和接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)是我國西北主產區(qū)的重要病原物[5]。

化學殺菌劑雖然可有效地控制馬鈴薯干腐病[6],但由于殺菌劑殘留、環(huán)境污染及誘導病原物產生抗藥性等問題使其應用逐漸受到限制。因此急需篩選安全、有效的防腐劑替代化學殺菌劑[7]。由自然界廣泛存在的幾丁質經脫乙酰作用得到的殼聚糖(chitosan)為地球上第二大可再生自然資源,是一種應用前景廣闊的天然防腐劑[8]。早在2001年就被美國FDA確認為“公認安全物質”(GRAS)[9]。殼聚糖具有廣譜的抗菌活性,對細菌[10]及青霉、毛霉、曲霉在內的多種真菌都具有較強的抑制作用[11-12]。殼聚糖可顯著抑制真菌的孢子萌發(fā)、芽管伸長、菌絲生長和孢子的形成[13-15],其抑菌活性取決于其分子量、脫乙酰度、溶液的pH以及目標生物的敏感度[16]。但尚未見殼聚糖對鐮刀菌的抑制報道。此外,殼聚糖還可用于多種果實采后病害的控制,對冬棗青霉病[17]、鮮食葡萄以及草莓的采后腐爛[18-19]均具有良好的控制效果。但尚未見殼聚糖對馬鈴薯塊莖干腐病的研究報道。本文擬研究不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum孢子萌發(fā)、菌落生長的抑制效果,以及不同濃度殼聚糖處理對損傷接種馬鈴薯塊莖切片病斑直徑的影響,以期為馬鈴薯干腐病的安全防治提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試馬鈴薯 (品種:隴薯3號)2013年10月采于甘肅省農業(yè)科學院渭源縣會川實驗基地;供試病原菌F.sulphureum甘肅省農業(yè)科學院植物保護所提供;F.sambucinum購于中國微生物菌種研究保藏管理中心;水溶性殼聚糖(食品級) 購于濟南海得貝海洋生物工程有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 每1L培養(yǎng)基:土豆 200g,葡萄糖 20g,瓊脂 15～20g,水1000mL,自然pH;瓊脂 北京康倍斯科技有限公司。

SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHP-9272B恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;CX21FS1C生物顯微鏡 奧林巴斯(廣州)工業(yè)有限公司;VXH-3微型漩渦混合器 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的配制 參照周德慶方法[20]。取25℃下培養(yǎng)7d的帶菌PDA平皿一個,加入含0.05% Tween80的無菌水約10mL,用涂布器刮下平板上的病原菌孢子,然后轉入50mL三角瓶中,在VXH-3微型旋渦混合器上振蕩15s,再用雙層紗布過濾,濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的濃度后,最后稀釋至所需濃度(1×106孢子/mL)。

1.2.2 不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum孢子萌發(fā)的影響 參照楊玲玉[21]方法。用鑷子夾取直徑為8mm的2%瓊脂培養(yǎng)基圓餅并將其置于滅菌的載玻片上,然后分別加入10μL 0.125%、0.25%、0.5%和1.0%的殼聚糖溶液于培養(yǎng)基上,殼聚糖溶液以無菌蒸餾水配制,對照組加入10μL無菌蒸餾水,再在其上加入10μL孢子懸浮液。置于28℃下,連續(xù)數小時鏡檢萌發(fā)率,直到對照基本完全萌發(fā)。每次鏡檢100個孢子,重復3次。

1.2.3 不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum菌落直徑的影響 參照盛占武[22]方法。分別取0.125%、0.25%、0.5%和1.0%的殼聚糖溶液100μL,均勻涂布在裝有20mL PDA,直徑為90mm的培養(yǎng)皿中,隨后將直徑8mm菌餅倒置于培養(yǎng)基中央,28℃避光培養(yǎng)5d,測定菌落直徑。以無菌水處理作為對照,每處理3個平行,重復3次。

1.2.4 不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum損傷接種塊莖切片病斑直徑的影響 參照Li[7]的方法并改進。選擇外觀整齊、無病蟲害、無損傷的馬鈴薯塊莖,清洗后用2%次氯酸鈉溶液浸泡2min,沖洗后將馬鈴薯塊莖切成10mm厚的切片,用直徑為35mm打孔器打成圓片。切片先用無菌水清洗,再用75%酒精擦洗并在酒精燈火焰上灼燒去除多余酒精,置于滅菌的濕濾紙上,室溫下黑暗放置4h。后取200μL濃度為0.125、0.25、0.5和1.0%的殼聚糖溶液,用滅菌的玻璃涂布器均勻涂布于馬鈴薯切片上,以無菌水處理為對照。然后在室溫下(20℃)黑暗培養(yǎng)24h后接種病原物。接種方法:分別取PDA上培養(yǎng)7d的8mm的F.sulphureum和F.sambucinum菌餅,倒置接種于處理后的馬鈴薯切片中央,3d后用十字交叉法測量病斑直徑,記錄數據。每個處理8個切片,重復3次。

1.3 數據處理

全部實驗數據用Microsoft Excel 2007 和SPSS13.0數據處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計處理。計算標準誤差(±SE)或進行Duncan’s 多重差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum孢子萌發(fā)的影響

殼聚糖處理可有效抑制F.sulphureum(圖1A)和F.sambucinum(圖1B)的孢子萌發(fā),對F.sambucinum的抑制效果優(yōu)于F.sulphureum,但各濃度處理之間沒有顯著性差異。F.sulphureum經不同濃度殼聚糖處理后的孢子萌發(fā)率僅約為同期對照的8%,而不同濃度殼聚糖處理幾乎完全抑制了F.sambucinum的孢子萌發(fā)。

圖1 不同濃度殼聚糖處理對F. sulphureum(A)和F. sambucinum(B)孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of chitosan at different concentrations on spore germination of F. sulphureum(A) and F. sambucinum(B)注:圖中不同字母代表差異顯著(p<0.05),豎線表示標準誤差(±SE)，圖2、圖3同。

2.2 不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum菌落直徑的影響

不同濃度殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum菌落生長的抑制效果存在差異,表現為低濃度有效而高濃度無效,其中0.25%殼聚糖處理對兩株菌的抑制效果最好,抑制率分別為7.46%和8.9%(圖1A、B)。雖然0.125%和0.25%的低濃度處理均顯著抑制了F.sulphureum和F.sambucinum菌落直徑的擴展,但兩濃度處理之間無顯著差異。當處理濃度升至0.5%時,僅對F.sambucinum的菌落生長顯著抑制,對F.sulphureum則表現無效。當處理濃度增至1%時,殼聚糖對兩株菌的菌落生長均表現無效。

圖2 不同濃度殼聚糖處理對F. sulphureum(A)和F.sambucinum(B)菌落生長的影響 Fig.2 Effects of chitosan at different concentrations on mycelial growth of F.sulphureum(A) and F.sambucinum(B)

2.3 不同濃度殼聚糖處理對損傷接種塊莖切片病斑直徑的影響

殼聚糖處理可有效抑制損傷接種塊莖切片病斑直徑的擴展,但抑制效果存在差異,其中以0.25%的處理效果最好,損傷接種F.sulphureum(圖3A)和F.sambucinum(圖3B)的病斑直徑分別比對照低45.3%和34.5%。0.125%殼聚糖處理對損傷接種F.sulphureum和F.sambucinum的病斑直徑與對照間無顯著性差異,0.5%殼聚糖處理可抑制兩株菌損傷接種病斑直徑的擴展,1%殼聚糖處理僅抑制了損傷接種F.sambucinum的病斑直徑。

圖3 不同濃度殼聚糖處理對損傷接種F. sulphureum(A)和F. sambucinum(B)塊莖切片病斑直徑的影響Fig.3 Effects of chitosan at different concentrations on lesion diameters of slices inoculated with F. sulphureum(A)and F. sambucinum(B)

3 討論

本文研究結果表明,殼聚糖處理能有效抑制F.sulphureum和F.sambucinum的孢子萌發(fā)。該結果與體外條件下殼聚糖抑制Botrytiscinerea和Alternariakikuchiana孢子萌發(fā)的結果基本一致[23-24]。殼聚糖對F.sulphureum孢子萌發(fā)抑制更為有效的原因可能與該病原物在孢子萌發(fā)階段對殼聚糖更為敏感有關[25]。由于殼聚糖的正電荷氨基與質膜磷脂的負電荷相互作用,造成質膜系統(tǒng)通透性的改變[17],從而破壞孢子質膜[26],導致孢子萌發(fā)失敗。

殼聚糖處理對F.sulphureum和F.sambucinum菌落生長所表現出的低濃度有效、高濃度無效的抑制結果,其中0.25%殼聚糖處理效果最好,該結果與Sudarshan等的研究類似[27],適當的低濃度殼聚糖處理可以與病原菌細胞表面所帶的負電荷中和,使細胞膠合在一起,而高濃度的殼聚糖可能使病原菌細胞表面帶一定數量的正電荷,從而使細胞處于懸浮狀態(tài),不能膠合[28]。另一方面,由于濃度高、黏度大的殼聚糖不易透過細胞壁;而低濃度的殼聚糖容易穿透細胞壁進入細胞內部,與細胞內物質進一步作用,擾亂病原菌的合成和代謝,導致病原菌不能正常生長和繁殖,從而發(fā)揮其抗菌作用[29-30]。

殼聚糖處理可有效抑制馬鈴薯塊莖切片損傷接種F.sulphureum和F.sambucinum的病斑直徑的擴展,其中以0.25%殼聚糖處理效果最好。這種抑制效果可能與殼聚糖處理誘導了塊莖的抗病性有關[31]。本實驗室前期研究表明,殼聚糖處理能明顯促進馬鈴薯切片活性氧的積累,增加過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶活性,降低超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶的活性,通過誘導活性氧迸發(fā)而啟動馬鈴薯組織的抗病反應[32]。更高濃度的處理并沒有達到更好的效果,可能與高濃度殼聚糖對塊莖切片造成了損傷,導致組織抗病力降低有關。

4 結論

殼聚糖處理可有效抑制F.sulphureum和F.sambucinum的孢子萌發(fā)和菌落生長,也可抑制損傷接種F.sulphureum和F.sambucinum塊莖切片的病斑直徑擴展。綜合比較不同濃度殼聚糖處理對馬鈴薯干腐病菌的抑制效果,0.25%濃度殼聚糖對馬鈴薯干腐病抑制效果最好。由此表明,殼聚糖除了直接的抑菌作用外,還具有誘導馬鈴薯塊莖抗病性的功能。

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Comparison of inhibition on two pathogensof dry rot in potato tubers by chitosan treatments

YAN Lu,KOU Zong-hong,BI Yang*,ZHU Yan*,LI Yong-cai,WANG Yi

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Dry rot is an important postharvest disease of potato tubers caused byFusarium. This study investigated the effects of chitosan at different concentrations againstF.sulphureumandF.sambucinumof dry rot pathogens in potato tubersinvitroandinvivo. Results indicated that chitosan significantly inhibited the spore germination of two pathogens. The rate of spore germination ofF.sulphureumwas 92% lower than the control,and ofF.sambucinumwas completely inhibited. Chitosan also inhibited the mycelium growth of two pathogens,the mycelium diameter were 7.46% and 8.9% lower than the control at 0.25% of the optimum treatment concentration. Its inhibition showed more effective toF.sambucinum. Chitosan inhibited the lesion diameter of slices inoculated withF.sulphureumandF.sambucinum,and lesion diameters were 45.3% and 34.5% lower than the control at 0.25% of the optimum treatment concentration. Efficacy was not enhanced when the concentration of chitosan was increased. It is proposed that chitosan treatment could directly inhibit pathogen growth and decrease dry rot of potato tubers by induced resistance.

potatoes;chitosan;dry rot

2014-09-18

燕璐(1989-),女,碩士研究生,研究方向:采后生物學。

*通訊作者:畢陽(1962-),男,博士,教授,研究方向:采后生物學與技術。 朱艷(1977-),女,博士,講師,研究方向:采后生物學與技術。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD06B03);地區(qū)科學基金項目(31460412);甘肅農業(yè)大學“伏羲人才”項目(FXYC20130110)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)13-0334-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.061