響應面法優(yōu)化水黃芹總黃酮提取工藝及其抗氧化研究

甘秀海,梁志遠,代 雄,趙 超,周 欣,*

(1.貴州師范學院 化學與生命科學學院,貴州貴陽 550018;2.貴州師范大學 天然藥物質(zhì)量控制研究中心,貴州貴陽 550001)

響應面法優(yōu)化水黃芹總黃酮提取工藝及其抗氧化研究

甘秀海1,梁志遠1,代 雄1,趙 超2,周 欣2,*

(1.貴州師范學院 化學與生命科學學院,貴州貴陽 550018;2.貴州師范大學 天然藥物質(zhì)量控制研究中心,貴州貴陽 550001)

目的:確定水黃芹中總黃酮的最佳提取工藝,并評價其抗氧化活性。方法:在單因素實驗基礎上,利用響應面法優(yōu)化水黃芹總黃酮的提取條件;通過總黃酮對DPPH·和ABTS·的清除作用來研究其抗氧化活性。結(jié)果:水黃芹總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度74%、料液比1∶30(g/mL)、提取溫度72℃、提取時間115min,此條件下,總黃酮得率為1.59%,與預測值1.60%接近,其偏差為0.63%。水黃芹總黃酮對DPPH·和ABTS·具有較好的清除能力,其IC50值分別為7.67、12.88μg/mL。

水黃芹,總黃酮,響應面法,抗氧化

水黃芹為馬鞭草科植物過江藤(Phylanodiflora(L.)Greene)的全草,我國主要分布于西南及江蘇、江西、福建等地。水黃芹又名苦舌草、番梨仔草等,全草入藥,能清熱解毒。主治咽喉腫痛、牙疳、泄瀉、痢疾;外用治癰疽瘡毒、帶狀皰疹、濕疹、疥癬等,民間用全草和肉燉食治黃腫病[1]。目前有關(guān)化學成分的研究報道主要集中在印度產(chǎn)的過江藤,其中含有較多的黃酮類、黃酮醇類及多酚類成分,其總黃酮含量為60.88mg/g[2-5]。黃酮類化合物具有廣泛的藥理作用,如:抗菌、抗腫瘤、抗氧化等作用,已被應用于食品、藥品、保健品及化妝品等領域[6-8]。但目前對于國內(nèi)產(chǎn)的水黃芹化學成分及抗氧化作用研究均未見報道。

因此,本實驗以總黃酮提取率為指標,采用乙醇回流法對水黃芹總黃酮的提取工藝進行研究,在單因素實驗的基礎上通過響應面法優(yōu)化了乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間,同時測定了水黃芹總黃酮對DPPH·和ABTS·的清除能力,以期為水黃芹資源綜合開發(fā)與利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水黃芹全株 購于貴州省貴陽市萬東橋藥材市場,經(jīng)貴州師范學院朱富壽教授鑒定為過江藤(Phyla nodiflora(L.)Greene)的全草;蘆丁標準品 購于中國藥品生物制品檢定所,批號111521-200303,供含量測定用;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),購于Sigma公司;維生素C,購于北京市金諾欣成化工有限公司;其它試劑均為分析純。

Cary-100紫外-可見分光光度計 美國瓦里安公司;Spectra Max Plus 384光吸收酶標儀 美國Molecular Devices公司;BSC-150恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司;XFB-200型中藥粉碎機 長沙市中南制藥機械廠;AL204型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;KQ-50B型超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司;Direct-Q3型超純水制備系統(tǒng) 密理博有限公司;HH-8型電熱恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水黃芹總黃酮的提取 水黃芹全草,粉碎,過60目篩,稱取1.0g于錐形瓶中,用一定體積分數(shù)的乙醇按一定料液比、提取溫度、提取時間加熱提取,趁熱抽濾,取濾液定容至50mL,即得水黃芹總黃酮提取液。

1.2.2 單因素實驗 以乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時間4個因素進行單因素實驗,平行3次,確定影響水黃芹總黃酮得率的適宜單因素條件。

1.2.2.1 乙醇濃度的確定 在料液比1∶20、提取溫度70℃、提取時間120min的條件下,分別考察40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇溶液對水黃芹總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 料液比的確定 在乙醇濃度70%、提取溫度70℃、提取時間120min的條件下,分別測定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)料液比條件下水黃芹總黃酮的得率。

1.2.2.3 提取溫度的確定 在乙醇濃度70%、料液比1∶20、提取時間120min的條件下,分別考察40、50、60、70、80、90℃不同提取溫度對水黃芹總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 提取時間的確定 在乙醇濃度70%、料液比1∶30、提取溫度70℃的條件下,考察30、60、90、120、150及180mim不同提取時間對水黃芹總黃酮得率的影響。

1.2.3 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D),利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken功能,以總黃酮提取率為響應值,采用四因素三水平的響應面分析法優(yōu)化水黃芹總黃酮的提取條件,各因素水平設計見表1。

1.2.4 標準曲線的繪制 以蘆丁標準品為對照品,按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[9-10]繪制吸光度值A與蘆丁濃度C(mg/mL)的標準曲線。

1.2.5 總黃酮提取率的計算 采用以上方法測定樣品溶液的吸光度,由回歸方程求出黃酮質(zhì)量濃度,并按下式計算總黃酮得率。

式中:C為測量液的總黃酮濃度,mg/mL;V0為提取液的定容體積,50mL;V1為測量液的定容體積,10mL;V2為測量時量取的體積,1.0mL;m為水黃芹干粉的質(zhì)量,1.0g。

表1 Box-Behnken實驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels used in the Box-Behnken design

1.2.6 總黃酮對DPPH·清除能力測定 參照文獻[11]的方法,將樣品及陽性對照品VC用甲醇配制成一系列濃度,測定不同濃度樣品及陽性對照品在515nm處的吸光度,每份樣品和陽性對照品平行操作3次,取平均值,計算出清除率,并計算出半數(shù)抑制率IC50值。

1.2.7 總黃酮對ABTS·清除能力測定 依據(jù)文獻[12]方法,將樣品用甲醇配制成一系列濃度,測定不同濃度樣品及陽性對照品在734nm處吸光度。每份樣品平行操作3次,取平均值,計算清除率,并計算出半數(shù)抑制率IC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復實驗的平均值,運用Excel數(shù)據(jù)處理軟件和Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

回歸方程為:A=11.811C-0.0159,R2=0.9998,表明蘆丁質(zhì)量濃度(C)在0.002～0.064mg/mL內(nèi)與吸光度(A)有良好線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對水黃芹總黃酮得率的影響 如圖1所示,水黃芹總黃酮得率隨乙醇濃度的增大先增大后減小。當乙醇濃度在70%時,其得率最高;乙醇濃度大于70%后,總黃酮得率隨乙醇濃度的增大而逐漸降低。這可能是因為乙醇濃度過低時,提取液中含有較多的糖類、蛋白質(zhì)等水溶性物質(zhì);而乙醇濃度過高,脂溶性物質(zhì)溶出較多,影響總黃酮的溶出,因此確定70%乙醇濃度為最佳條件。

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration flavonoids extraction

2.2.2 料液比對水黃芹總黃酮得率的影響 由圖2可知,隨料液比的增大,水黃芹總黃酮得率增大,當料液比達到1∶30(g/mL)后,得率增大減緩。這說明此時總黃酮已基本溶出,增加溶劑的量并不能明顯提高總黃酮的提取量,因此確定最佳料液比為1∶30(g/mL)。

圖2 料液比對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on flavonoids extraction

2.2.3 提取溫度對水黃芹總黃酮得率的影響 如圖3所示,水黃芹總黃酮得率隨提取溫度的升高先增大后減小。當溫度為70℃時,總黃酮的得率達最高值;當溫度高于70℃后,總黃酮的得率隨溫度的升高反而降低。這可能是因為溫度過高,黃酮的穩(wěn)定性降低,進而含量降低。因此,選擇提取溫度為70℃。

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of temperature on flavonoids extraction

2.2.4 提取時間對水黃芹總黃酮得率的影響 由圖4可知,水黃芹總黃酮得率隨提取時間的延長而增大,當時間為120min時,總黃酮的得率達較高值;繼續(xù)延長提取時間,對總黃酮的得率影響較小,這說明120min總黃酮已基本溶出。因此,為了節(jié)約時間,降低能耗,選擇提取時間為120min。

圖4 提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of time on flavonoids extraction

2.3 響應面法優(yōu)化總黃酮提取工藝

2.3.1 實驗設計及結(jié)果 以單因素實驗結(jié)果為基礎,利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化水黃芹總黃酮的提取條件,其設計方案及結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析[13-14],得到總黃酮提取率(Y)對因素A、B、C及D相應的二次方程模型:Y=1.588+0.109A-0.003B-0.017C+0.021D-0.003AB+0.023AC-0.016AD-0.017BC-0.011BD+0.010CD-0.160A2-0.082B2-0.065C2-0.089D2。同時對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,其結(jié)果見表3。

表2 響應面實驗設計及結(jié)果Table 2 Experiment design and result of RSM

表3 回歸模型參數(shù)檢驗Table 3 Parameter estimate of regression model

注:***差異極顯著(p<0.001);**差異高度顯著(p<0.01);*差異顯著(p<0.05)。

由表3可看出回歸方程擬合檢驗p<0.0001,差異極顯著,說明模型的預測值和實際值非常吻合,模型可靠。回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9900,顯示響應值的變化99.00%來源于乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)四個變量;同時失擬檢驗p>0.05,說明未知因素對實驗結(jié)果影響較小。因此,建立的回歸方程能準確地描述響應值與各因素之間的真實關(guān)系。另外,各因素一次項A、D及二次項A2、B2、C2、D2對黃酮提取的影響極顯著,C(提取溫度)對黃酮提取的影響高度顯著。由F值可得出各因素對總黃酮提取率的影響程度大小順序為乙醇濃度>提取時間>提取溫度>料液比。

2.3.2 各因子交互作用對黃酮得率影響的分析 利用軟件,在其它因素為零水平上,選擇乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間四個變量中的兩個交互因素對總黃酮得率的影響進行分析,回歸優(yōu)化得到相應的響應面圖及等高線圖,等高線圖的形狀可反映因素間交互作用的強弱,圖形趨向橢圓且橢圓軸線與坐標軸的角度越大,則交互作用越明顯,反之則交互作用越弱[15]。由此分析所有等高線圖與相應曲面,其中顯著交互項的響應曲面見圖5,由圖可知,在一定范圍內(nèi),總黃酮得率隨乙醇濃度和提取溫度的提高而增大,在交互作用等高線中,等高線沿A軸方向變化相對密集,說明乙醇濃度對響應值峰值的影響大于提取溫度,與回歸分析結(jié)果相同。

圖5 乙醇濃度和提取溫度交互作用對總黃酮得率的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the effect of ethanol concentration and extraction temperature

2.4 最佳提取工藝及驗證

結(jié)合回歸模型的數(shù)學分析結(jié)果,水黃芹總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度73.4%、料液比1∶29.7(g/mL)、提取溫度71.9℃、提取時間115.2min,此條件下的預測得率為1.61%。考慮到實際操作的便利,將水黃芹總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)修正為:乙醇濃度74%、料液比1∶30(g/mL)、提取溫度72℃、提取時間115min,此條件下總黃酮的理論得率為1.60%。以最佳提取工藝條件,重復三次實驗,得到水黃芹總黃酮的得率為1.59%。兩者相比,相對誤差約為0.63%,說明響應面法優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.5 抗氧化能力的測定

總黃酮樣品及陽性對照品VC對兩種自由基的清除能力如圖6及圖7。由圖6、圖7可知,水黃芹總黃酮對DPPH·和ABTS·的清除能力隨濃度的增加而增大,當清除率達到50%時,所需的總黃酮濃度IC50分別為7.67、12.88μg/mL,弱于陽性對照VC(分別為6.05、9.92μg/mL)。

圖6 VC與水黃芹總黃酮對DPPH·的清除能力Fig.6 DPPH·radical scavenging activities of VC and total flavonoids from Phyla

圖7 VC與水黃芹總黃酮對ABTS·的清除能力Fig.7 ABTS·radical scavenging activities of VC and total flavonoids from Phyla

3 結(jié)論

本實驗在考察乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間對總黃酮得率影響的基礎上,采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken方法設計響應面實驗優(yōu)化水黃芹總黃酮的提取工藝。通過方差分析得到各因素對總黃酮得率的影響作用為:乙醇濃度>料液比>提取時間>提取溫度。優(yōu)化后總黃酮的最佳提取工藝為:乙醇濃度74%、料液比1∶30(g/mL)、提取溫度72℃、提取時間115min,此條件下水黃芹總黃酮的得率為1.59%,與預測值基本相符?？寡趸钚员砻?水黃芹總黃酮對DPPH·和ABTS·具有較好的清除作用,但均弱于陽性對照VC。本研究為后續(xù)水黃芹的研究與合理開發(fā)提供了一定的理論參考依據(jù)。

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Optimization of extracting total flavonoids fromPhylanodiflora(L.)by response surface methodology and its antioxidant activity

GAN Xiu-hai1,LIANG Zhi-yuan1,DAI Xiong1,ZHAO Chao2,ZHOU Xin2,*

(1.The School of Chemistry and Life Science,Guizhou Normal College,Guiyang 550018,China;2. The Research Center for Quality Control of Natural Medicine,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

Objective:To explore the optimum extraction process of total flavonoids fromPhylanodiflora(L.)and evaluate the antioxidant activity. Methods:Based on the single-factor tests,the extraction conditions of total flavonoids fromPhylanodiflora(L.)were optimized by response surface methodology. Meanwhile,the antioxidant activity of total flavonoids was assessed by scavenging assays of DPPH· and ABTS· Results:The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration 74%,liquid-solid ratio 1∶30,extraction temperature 72℃ and extraction time 115min. Under the optimal conditions,the extraction rate of total flavonoids was 1.59%,which was close to the predicted value 1.60% with 0.63% bias. In addition,DPPH· and ABTS· radical scavenging capacity of total flavonoids was better,and IC50of it was 7.67μg/mL and 12.88μg/mL,respectively.

Phylanodiflora(L.);total flavonoids;response surface analysis;antioxidant

2014-10-28

甘秀海(1976- )，男，碩士，副教授，從事天然藥物化學研究。

貴州省應用化學特色重點學科(黔教科研發(fā)[2012]442號)；貴州省教育廳特色重點實驗室項目(黔科合KY[2012]005號)；貴州師范學院科學研究項目(201209)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)13-0238-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.042

*通訊作者:周欣(1962- )，女，博士，教授，研究方向：中藥質(zhì)量控制及新藥開發(fā)。