戊糖乳桿菌S14所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的生物學(xué)特性研究

蘇日娜,吳青海,雙 全

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

蘇日娜,吳青海,雙 全*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

以內(nèi)蒙古東部地區(qū)酸菜中分離得到的具有產(chǎn)抑菌活性的戊糖乳桿菌S1-4為供試菌,以大腸桿菌(Escherichiacoli)3301為指示菌,采用雙層瓊脂擴散法對其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)的抑菌物經(jīng)木瓜蛋白酶處理后,其抑菌活性明顯降低,但對胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感。該抑菌物質(zhì)經(jīng)熱處理后,對大腸桿菌仍保持較強的抑菌活性,在pH3.5～5.5條件下,其抑菌活性較穩(wěn)定。該菌株的發(fā)酵上清液分別經(jīng)部分化學(xué)試劑和紫外線照射處理后,仍保持較好的抑菌活性。

戊糖乳桿菌,抑菌物質(zhì),生物學(xué)特性

細(xì)菌素(Bacteriocin)是天然的微生物防腐劑,是某些細(xì)菌在代謝過程中通過其核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或其前體[1],對其它種類的細(xì)菌具有一定的抑制作用[2]。細(xì)菌素可以殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物[3],而且具有自身免疫性[4],如免疫抑制、免疫激活和免疫增強等功能。由于細(xì)菌素具有無致畸、無毒性蓄積作用、不易產(chǎn)生耐藥性、大多數(shù)產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌都是從天然食品中分離出來等優(yōu)點,所以細(xì)菌素適合在食品中應(yīng)用[5]。

戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)[6]廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品及醉魚中[7-10],是公認(rèn)的食品安全菌。國內(nèi)外學(xué)者對戊糖乳桿菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)也進(jìn)行過大量研究,最早報道戊糖乳桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)是在1999年有關(guān)pentocin TV35b 的分離純化[11],而我國是在2004 年第一次報道了pentocin 31-1的分離純化[12]?，F(xiàn)已報道過的產(chǎn)細(xì)菌素的戊糖乳桿菌有Lb. pentosus ST151BR[13]、Lb. pentosus S-PT84[14]、Lb. pentosus IG1[15]和Lb. pentosus204[16]等。戊糖乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素是屬于II 類細(xì)菌素,分子量較小、主要抑制革蘭氏陽性菌,也能抑制革蘭氏陰性菌。因可耐受高溫處理,并且多數(shù)都在酸性或弱堿性條件下穩(wěn)定[17],所以具有廣泛的應(yīng)用前景。

表1 不同處理對菌株S1-4抑菌活性的影響Table 1 Antimicrobial activity of strain S1-4 after different treatments

注:-：抑菌圈直徑≤8mm,表示沒有抑菌效果。本文從內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)酸菜中分離得到的具有產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的戊糖乳桿菌S1-4作為供試菌,對其發(fā)酵產(chǎn)物在酶、熱以及其它各種處理時的生物學(xué)特性進(jìn)行研究,為乳酸菌細(xì)菌素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株 戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)S1-4,分離自內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁液;指示菌 大腸桿菌(Escherichiacoli)3301,來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗室;脫脂乳培養(yǎng)基 脫脂乳粉100g/L、酵母提取粉10g/L;MRS液體培養(yǎng)基 大豆蛋白10g/L、牛肉膏5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、Tweeen 80 1mL/L、磷酸二氫鈉2g/L、無水乙酸鈉5g/L、檸檬三胺2g/L、硫酸錳0.02g/L、硫酸鎂0.1g/L;LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司;SX-500高壓滅菌鍋 德國TOMY公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;OHAUS EX623電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;SK-1快速混勻器 常州國華電器有限公司;PHS-25型數(shù)顯酸度計 中國雷磁分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株S1-4發(fā)酵上清液的制備 菌株S1-4經(jīng)活化后按2%(V/V)接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)24h后離心(6000r/min、15min)取上清液,采用直徑0.22μm微孔濾菌器過濾,取得發(fā)酵上清液,放置于4℃冰箱保藏待用。

1.2.2 抑菌活性的測定 乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌活性測定采用雙層瓊脂擴散法,先以1%的無菌瓊脂水溶液在培養(yǎng)皿底層打底,待瓊脂凝固后在上面均勻擺放牛津杯,再倒帶有指示菌的固體培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后取牛津杯,在其形成的孔內(nèi)加0.2mL的發(fā)酵上清液,在37℃培養(yǎng)24h后測量其抑菌圈直徑[19]。

1.2.3 戊糖乳桿菌S1-4 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對酸及酸性末端產(chǎn)物作用的檢測與排除實驗 將菌株S1-4發(fā)酵上清液分別用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至(5.50±0.02),以乳酸和乙酸調(diào)pH至(5.50±0.02)的滅菌蒸餾水為對照,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗。

1.2.4 戊糖乳桿菌 S1-4 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對過氧化氫作用的檢測與排除實驗 在50mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)中溶解過氧化氫酶,配成母液,加入菌株S1-4的發(fā)酵上清液使最終濃度達(dá)到5mg/mL,37℃水浴2h,以未處理的戊糖乳桿菌發(fā)酵上清液為對照,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗。

1.2.5 戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對蛋白酶的敏感性實驗 將3種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)分別溶解在50mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)中配成母液,分別加入到經(jīng)酸及過氧化氫排除后的菌株S1-4發(fā)酵上清液中,用HCl、NaOH 調(diào)節(jié)pH為以上各酶的最適作用pH,使它們的終質(zhì)量濃度為1mg/mL,置于37℃水浴中2h后取出,pH調(diào)回5.0,并以未處理的上清液作為對照,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗,檢測各種蛋白酶對戊糖乳桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性的影響。

1.2.6 不同熱處理對戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響 將菌株S1-4發(fā)酵上清液分別在不同溫度(45、60、80、100、121℃)下處理15min和30min,以未經(jīng)處理的發(fā)酵液為對照,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗。

1.2.7 不同pH對戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響 將菌株S1-4發(fā)酵上清液用1mol/L的HCl和2mol/L的NaOH溶液調(diào)整至不同的pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0),以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗,以未接種過的MRS液體培養(yǎng)基調(diào)到相應(yīng)的pH作為對照。

1.2.8 紫外線處理對戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響 取相同體積的發(fā)酵上清液6份,倒入無菌平皿中,鋪成約 1mm薄層,在無菌條件下用40W紫外燈照射1、2、3、4、5、6h。以未照射過的發(fā)酵液作為對照,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗。

1.2.9 表面活性劑及NaCl處理對戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響 在菌株S1-4發(fā)酵上清液中分別加入Triton X-100、EDTA、吐溫 80、吐溫20、SDS和NaCl,使各物質(zhì)的終質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL,30℃溫浴2h,以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實驗,并以未經(jīng)化學(xué)試劑處理的發(fā)酵上清液作為對照,確定此抑菌物質(zhì)的化學(xué)試劑穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S1-4抑菌物質(zhì)的確定

乳酸菌在生長過程中除產(chǎn)生細(xì)菌素外,還可代謝產(chǎn)生有機酸、H2O2等其他具有抑菌活性的成分,因此,需排除這些干擾因素以確定抑菌作用是由細(xì)菌素產(chǎn)生。為了排除酸性末端產(chǎn)物的干擾,調(diào)發(fā)酵上清液的pH至5.5,分別以pH5.5的乳酸和乙酸作對照進(jìn)行抑菌實驗(表1)。

結(jié)果表明,排酸作用后,菌株S1-4仍有一定的抑菌作用,說明發(fā)酵上清液中的抑菌性不是有機酸作用的結(jié)果,還有其他抑菌物質(zhì)存在。乳酸菌在代謝過程中會產(chǎn)生過氧化氫,有抑菌的作用。菌株S1-4發(fā)酵上清液經(jīng)H2O2酶處理后,發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑與原液抑菌圈直徑不顯著,說明發(fā)酵上清液中過氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì),還有其他的抑菌物質(zhì)存在。

2.2 菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)對蛋白酶處理的穩(wěn)定性

不同蛋白酶對菌株S1-4發(fā)酵上清液處理后的抑菌效果見圖1。

圖1 不同蛋白酶處理對菌株S1-4發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.1 Effects of Protease on the anti-bacterial activity of strain S1-4注:同列肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同字母為差異不顯著(p>0.05);圖2～圖4同。

由圖1可知,菌株S1-4所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)對不同蛋白酶表現(xiàn)出不同敏感性,經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后,透明圈直徑略有減小,但仍具有很明顯的抑菌作用,經(jīng)木瓜蛋白酶處理后抑菌活性明顯減小,所以對其較敏感?？赡苁且驗槟竟系鞍酌笇儆趲€基蛋白酶類,許多蛋白質(zhì)和肽類都有水解作用所致[20]。該抑菌物質(zhì)為非蛋白組分或者起抑菌作用的不是單一的物質(zhì),關(guān)于其具體成分有待進(jìn)一步研究。

2.3 菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)對熱處理的穩(wěn)定性

菌株S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)經(jīng)不同溫度、不同時間處理時的抑菌效果如表2 所示。

表2 熱處理對菌株S1-4發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Table 2 Effect of anti-bacterial activity of strain S1-4 for heat treatment

從表2可以看出,菌株S1-4 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性,無細(xì)胞發(fā)酵上清液在80℃,30min 的熱處理條件下活性不變,隨著溫度的繼續(xù)升高和加熱時間的延長,菌株S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性呈上升趨勢,在121℃,30min的熱處理條件下其抑菌圈直徑可達(dá)27.95mm,這個實驗結(jié)果與菌株pentocin LPEM818[21]的結(jié)果類似,貢漢生[22]等分析可能由于加熱使細(xì)菌素的構(gòu)象發(fā)生變化,更多的抑菌活性位點暴露出來,具體原因需進(jìn)一步實驗驗證。

2.4 不同pH對發(fā)酵上清液抑菌活性的影響

菌株S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對不同pH的穩(wěn)定性結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH對菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on the anti-bacterial activity of strain S1-4

由圖2可知,菌株S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在偏酸的環(huán)境中有較強的抑菌性,抑菌活性的pH范圍為3.5～5.5,其酸性越強,抑菌活性就越強;當(dāng)pH≥6 時,細(xì)菌素基本沒有抑菌性。這說明菌株S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在酸性條件下有較好的穩(wěn)定性。這與牛愛地等研究乳桿菌A5[23]的結(jié)果類似。

2.5 戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對紫外線的穩(wěn)定性

戊糖乳桿菌S1-4發(fā)酵上清液經(jīng)紫外線照射處理結(jié)果見圖3所示。

圖3 紫外線照射對菌株S1-4發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.3 Effect of UV radiation on the anti-bacterial activity of strain S1-4

由圖3可知,經(jīng)紫外線照射處理lh至6h后其抑菌活性沒有太大的變化,同對照組相比,對大腸桿菌的抑菌效果沒有顯著的差異,所以戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后仍保持較好的穩(wěn)定性。

2.6 戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對表面活性劑及NaCl穩(wěn)定性的研究

對化學(xué)試劑穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 表面活性劑及NaCL對菌株S1-4發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的影響Fig.4 Effect of surfactant and NACL on the anti-bacterial activity of strain S1-4注:1.NaCl,2.SDS,3.EDTA,4.Triton X-100,5.吐溫20,6.吐溫80,7.對照。

從圖4可以看出,戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)經(jīng)SDS、Triton X-100、EDTA、吐溫 80、吐溫 20和NaCl處理后沒受明顯影響,抑菌活性仍然保持穩(wěn)定。而加入EDTA后抑菌活性明顯的增加。EDTA是典型的絡(luò)合劑,對革蘭氏陽性菌的抑制作用則主要是由于 EDTA 與金屬離子結(jié)合,對革蘭氏陰性菌的抑制作用是起到外膜滲透作用。本實驗結(jié)果與相近的植物乳桿菌素C19[24]、片球菌素ST18[25]的研究報道基本一致,即SDS和Triton X-100都不會使抑菌物質(zhì)的活性消失。

3 結(jié)論

3.1 戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)經(jīng)蛋白酶處理結(jié)果,對木瓜蛋白酶較敏感,其抑菌圈的平均直徑由26.65mm降到17.80mm,而受胃蛋白酶和胰蛋白酶影響較小,處理前后其抑菌圈直徑基本沒有變化。因此可推測該抑菌物質(zhì)為非蛋白組分的肽類或不是單一的物質(zhì)。

3.2 戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)經(jīng)熱處理后仍保持良好的抑菌活性,在121℃熱處理條件下其抑菌活性呈上升趨勢,這可能是因為加熱使抑菌物質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化,更多的抑菌活性位點暴露出來所致。

3.3 菌株S1-4在pH3.5～5.5 時具有較強的抑菌活性,所以戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在酸性條件下有較強抑菌活性。

3.4 戊糖乳桿菌S1-4發(fā)酵上清液經(jīng)紫外線照射處理1h至6h后其抑菌活性沒有太大的變化,所以對紫外線照射具有較好的穩(wěn)定性。

3.5 戊糖乳桿菌S1-4發(fā)酵上清液經(jīng)SDS、Triton X-100、吐溫80、吐溫20、NaCl等處理后抑菌活性仍然保持穩(wěn)定。

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Characterization of antibacterial substance producedbyLactobacilluspentosusS1-4

SU Ri-na,WU Qing-hai,SHUANG Quan*

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The characteristics of antibacterial substances ofLactobacilluspentosusS1-4,isolated from the sour cabbage juice in the east aria Inner Mogolia,were tested forEscherichiacoli3301 as the indicator by the double agar diffusion method. The results showed that the antibacterial activity of strain S1-4 was not destroyed after treatment with papain,but destroyed after treatment with pepsin and trypsin. This antibacterial substances ofLactobacilluspentosusS1-4 showed good thermal stability and stable antibacterial activity under acidic conditions in pH3.5～5.5. The inhibitory activity of this strain fermentation supernatant was not affected by some chemical agents and ultraviolet irradiation treatment.

Lactobacilluspentosus;antibacterial substance;biological characteristics

2014-08-25

蘇日那(1989-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù)。

*通訊作者:雙全(1964-),男,博士,教授,研究方向:食品科學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(31460443)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.027